川崎病冠状动脉损伤机制免疫遗传研究进展

邱佳韵综述 周国平审校

南京医科大学第一附属医院儿科（江苏南京 210029）

川崎病（kawasaki disease，KD）又称皮肤黏膜淋巴结综合征，可引起全身血管，尤其是冠状动脉的病理性改变，给冠状动脉带来永久性损伤。尽管当前标准治疗方法即静脉注射丙种球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）和口服阿司匹林已将KD 患者的冠状动脉并发症发生率从20%～25%控制到5%～15%[1-2]，仍有部分患者因IVIG 抵抗等原因难以避免永久性冠状动脉病变（coronary artery lesion，CAL）的风险。因此，从免疫遗传角度探讨川崎病冠状动脉损伤的机制具有重要临床意义。虽然当前这方面研究尚不清晰，但是最近国内外学者也提出了一些新成果与构想。本文基于国内外最新研究及研究争议进行综述，以增加对川崎病冠状动脉损伤机制的认识，为未来的新诊断方法、治疗靶点及预后情况的判断奠定基础。

1 KD相关基因

1.1 生物信息学检测的易感基因

目前已有47个基因与KD的冠状动脉损伤有关，主要可按照机制分为4 组：增强T 细胞活化（1,4,5三磷酸肌醇3激酶C基因、ORAI1基因、STIM1基因）、B细胞信号转导失调（CD40基因、B淋巴细胞激酶、FCGR2A基因）、减少细胞程序性死亡（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1、3）和改变转化生长因子信号（转化生长因子-β2、转化生长因子-β受体II型、基质金属蛋白酶、SMAD基因）[3]。

研究显示，心脏缺血性纤维化或弥漫性纤维化常常是KD 患者出现冠状动脉瘤及不良预后的评估和预测指标[4]。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可以通过磷酸化其下游的SMAD3 (drosophila mothers against decapentaplegic protein 3)，诱导胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ等基因的转录，参与心血管重塑与纤维化。TGF-β/SMAD通路已成为众多学者公认的改善心脏纤维化的潜在治疗靶点[5]。目前已经证实TGF-β2、转化生长因子-β 受体Ⅱ型（transforming growth factor-β receptor type Ⅱ，TGFBR2）与KD易感性、动脉扩张、动脉瘤、IVIG治疗反应的相关性[3,6-7]。尽管部分实验仍存在样本量小、基因标记局限性等问题，但不可否认，TGF-β、TGFBR 2、SMAD 一定程度上参与KD CAL 的形成与进展。

IgG 受体Ⅱa 的Fc 片段（Fc fragment of IgG receptor Ⅱa，FCGR2A）是经过反复验证的KD易感基因之一，但其与CAL的相关性目前仍有争议[3,8-9]。既往研究认为FCGR2A仅与KD严重程度、IVIG治疗抗药性有关，但与心血管并发症无关[3,8]。然而与之相反，最近有学者提出FCGR 2 A 可能通过间接影响其他细胞因子，维持C 反应蛋白介导的炎症反应持续存在，从而参与自身免疫和心血管相关的炎症性疾病的发展[10]。一项meta 分析中也发现了FCGR2A与KD 冠状动脉瘤的可能关联位点[9]。由此可见，FCGR2A对KD CAL的相关性研究有待进一步探索与更新。

SHR和Wistar大鼠模型显示基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1，STIM1）及ORAI1的异常表达可能通过影响L型钙离子通道和钙池操纵性钙通道，造成钙平衡调节的紊乱、增加T细胞活化，引起冠状动脉血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）功能异常，从而导致CAL 的形成[3,11-12]。此外，多项meta 分析发现半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1、3 可能与KD CAL、IVIG 抗性有关，它们可能通过细胞凋亡、内皮性焦磷酸化等方式损伤内皮、减少血管生成及促进心肌纤维化来参与KD CAL[3,13-14]。

除上述4 组易感基因外，国内外学者还检测出一些其他KD 相关的易感基因。全基因组关联研究发现，AGT基因的变异虽然与KD 易感性无关但与12 个月以下的KD 儿童的CAL 风险相关[7]。尽管因样本量较少，结果仍存在不确定性，但其也为后期KD 相关基因研究提供了方向。同时该研究结果也进一步揭示了KD易感基因与KD CAL相关基因的分离，即两者分别由不完全相同的基因影响和操控[7,9]。此外，另一组南方KD病例样本的分析发现，TNFRSF 11 A基因的CC 基因型可能是KD 冠状动脉损伤的保护因素，尤其是对于≤60 个月的KD 患者[15]，暗示了KD CAL相关基因可能存在时间上的影响分化。

尽管仍需要进一步实验的验证，部分参与CAL形成机制的KD易感基因为早期预防提供了思路。

1.2 miRNA

除部分易感基因外，miRNA 也是调控冠状动脉损伤的关键因素。miRNA 是一组18～25 个小核苷酸共同组成的非编码RNA，可通过与目标mRNA的3'不可翻译区(UTR)不完全杂交来调节和控制基因表达，参与细胞增殖、生长、凋亡和重要生物过程的代谢[16]。

1.2.1 miR-92、miR-93 血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）能与血管内皮表面受体结合，通过一氧化氮的释放间接引起血管生成、血管舒张，刺激单核巨噬细胞和粒细胞的趋化。miR-92a通过上调VEGFA促进血管生成，防止血管损伤后的心内膜形成，并通过抑制丝裂原活化蛋白激酶4（MAP kinase kinase 4，MKK4）和c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-jun n-terminal protein kaiser，JNK)通路阻碍内皮细胞凋亡[17]，提示miR-92a对CAL的潜在治疗作用。此外，VEGFA mRNA还被发现与miR-93 的表达呈负相关[18]，提示miR-93 可能对KD 的冠脉损伤有保护作用，有一定预后判断价值。综上可以推测，miR-92a、miR-93可作为KD CAL的潜在治疗靶点。

1.2.2 miR-145 目前研究表明miR-145-5 p 和miR-145-3p在难治性KD患者中表达显著增高，可能通过与其他miRNA 共同调控TGF-β 通路参与IVIG 治疗反应及疾病严重程度的基因调节[19-20]。Wu等[21]研究也肯定了miR-145对疾病严重程度的预测能力，他们还指出miR-145 的过表达可以通过靶向下调叉头盒蛋白O1来改善内皮损伤、促进细胞增殖和迁移，提示了miR-145的治疗潜力。

1.2.3 miR-197-3p miR-197-3p在KD冠状动脉损伤中的功能可从多方面进行解释。一方面，基质金属蛋白酶9（matrix metallo proteinase 9，MMP9）是冠脉损伤的关键因素。增加的miR-197-3 p 通过直接抑制组织金属蛋白酶抑制因子3（tissue inhibitor of matrix metallo proteinase 3，TIMP3）的表达，提高MMP 9 表达及血管内皮损伤标志物血小板反应蛋白1、血管性血友病因子、人硫酸肝素蛋白聚糖2 的水平来诱导人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）的损伤和血管壁动脉瘤产生[19]。另一方面，胰岛素样生长因子1 受体 (insulin-like growth factor 1，IGF-1R)是VSMC中的直接靶基因，且是VSMC和内皮细胞凋亡的重要调节因子。B 细胞淋巴瘤2 (B cell lymphoma-2，BCL2)是细胞凋亡的关键基因。miR-197-3p可能通过直接靶向KD血清诱导的IGF-1R和BCL2来抑制HCAECs的增殖和迁移并促进细胞凋亡。由此可见，抗凋亡基因可能是miR-197-3p的直接靶点[18]。综上可以认为miR-197可作为KD CAL的预测因子及预后指标。

1.2.4 miR-125 a-5 p miR-125 a-5 p 能诱导内皮细胞凋亡，可作为KD 新标志物[18]。基于MKK 7 参与JNK 信号通路的调控，影响细胞凋亡在内的多种细胞内事件的前提，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中miR-125a-5p通过抑制MKK7水平调节Bax/Bcl2通路，以此激活半胱天冬氨酸蛋白酶3，诱导促凋亡蛋白Bax 表达，同时抑制抗凋亡Bcl-2 蛋白表达水平从而诱导HUVEC 凋亡[20]。miR-125 a-5 p还可以通过抑制内皮素-1（endothelin，ET-1），间接调节VEGF和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表达，抑制血管生成[20]。由此可以推测，靶向抑制miR-125a-5p相关通路可以促进内皮细胞增殖和血管修复，miR-125 a-5 p可能成为KD CAL治疗的新的研究方向。

1.3 lncRNA

lncRNA可以通过转录、转录后和表观遗传调控来调节基因表达并影响信号通路。有关研究发现，lncRNA XLOC_006277 对CAL 的上游信号至关重要，可能成为CAL 发展的新型预测指标[22]。部分lncRNA对CAL还有保护作用，可能成为KD治疗的新位点。例如，lncRNA NEAT 1 可能通过激活miR-140-3p/丝裂原活化蛋白激酶1通路增加细胞活力并抑制CAL 细胞凋亡，揭示了lncRNA NEAT 1 作为CAL治疗靶点的潜在意义[23]。

1.4 circRNA

circRNA 作为miRNA 海绵可以间接增加编码mRNA 的翻译水平，部分circRNA 也可作为KD CAL 患者疗效和预后的评估指标。有研究发现，高尔基体膜和微管假基因1及锌指蛋白124的circRNA（circ-WHAMMP1和circ-ZNF124）有可能分别通过调控miR-663b和miR-181b-5p参与CAL机制[24]；此外也有发现circ-YOD 1 可能可以作为CAL 的诊断或预后判断标志物[25]。lncRNA 与circRNA 为miRNA水平的研究开拓了新的思路，现已成为新的研究热点。

2 相关蛋白

蛋白标志物是除基因以外的另一类冠状动脉损伤介导因素，主要与炎症免疫失衡、内皮细胞损伤及功能障碍有关，这两者是已经公认的KD CAL 核心形成机制。目前已发现周期性色氨酸蛋白2（periodic tryptophan protein 2，PWP 2）、微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance protein，MCM）、SLD 5（GINS 复合物的亚基）、组蛋白去乙酰化酶2（histone Deacetylase 2，HDAC 2）等多种相关标志物在不同程度上参与CAL 诊断、IVIG 疗效判断等过程[26]。

PWP 2 主要功能是促进核糖体的合成与加工，PWP 2 下调可能抑制冠状动脉内皮细胞增殖，加重内皮细胞损伤[26]。由此推测PWP 2 可能可以作为冠状动脉损伤程度的判断标准。MCM 的功能是对DNA 复制中高水平复制起始位点的选择，SLD 5 能激活MCM的此项功能。SLD5的下调能限制冠状动脉内皮细胞增殖时的DNA 复制过程从而加重内皮细胞损伤[26]。因此上调MCM 与SLD 5 可能对血管内皮功能起保护作用。综上，PWP 2、MCM、SLD 5不仅能作为诊断指标，还可为临床治疗的疗效提供直观反映。

T N F-α 和I L-1 β 介导分泌的穿透素-3（pentraxin-3，PTX-3）是一种可溶性模式识别受体，主要参与先天性免疫系统激活、炎症反应、血管生成等。有研究发现，PTX-3水平与各炎症指标高度相关，尤其是对IVIG耐药的CAL患者。此外，PTX-3能与P 选择素相互作用，通过一氧化氮途径减少内皮细胞中氮氧化合物合成，减少细胞增殖和功能，从而引起血管内皮功能障碍的发生。与此同时，PTX-3 还能通过抑制成纤维细胞生长因子2来抑制血管生成与修复[27-28]。综上可以认为PTX-3参与KD冠脉损伤的发病机制，可作为KD 冠状动脉损伤患者的诊断指标和IVIG疗效判断的预后指标，尤其是针对难治性KD患者。

3 相关通路

冠状动脉内皮损伤、炎症激活、VSMC 去分化及功能障碍是KD CAL 的重要形成因素，常能导致病理性血管重塑及永久性冠状动脉损伤[1]。对基因与蛋白标志物等致病原理进一步探索，当前研究发现核转录因子NF-κB（nuclear transcription factorκB，NF-κB）、smad1/5-Runt相关转录因子2（Runt related transcription factor 2，runx2）、磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinase/ protein kinase B，PI3K/ Akt）、Ca2+/激活T-细胞核因子1（Ca2+/nuclear factor of activated T-cells，Ca2+/NFAT）等通路，通过调节不同细胞因子、基因或蛋白等，成为CAL形成的重要调控途径。

3.1 NF-κB通路

NF-κB 通路主要参与编码促炎因子、趋化因子、黏附分子等炎症相关基因的转录，可以通过氧化应激等因素诱导激活，参与冠状动脉等血管损伤[29]。目前已有较多研究证实了NF-κB 通路对KD CAL的干预。

3.1.1 HMGB1/RAGE/NF-κB通路 高迁移率组蛋白1（high-mobility group box 1 protein，HMGB1）一方面能促进免疫细胞释放各种促炎因子，这些促炎因子进一步促进单核巨噬细胞、内皮细胞、NK细胞等分泌HMGB1，形成正反馈回路，促使炎症持续递进。另一方面，HMGB1与晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）的结合促进了丝裂原的激活和p38激酶、c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶1/2等蛋白激酶的磷酸化，进而激活多种信号通路，如NF-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶，诱导炎症的发展[30]。由此可见，干扰HMGB1/RAGE/NF-κB通路能有效减少炎症引起的KD 内皮损伤，从而抑制病理性血管重塑和CAL。

3.1.2 E-选择素 E-选择素主要参与炎症细胞的黏附过程，较高浓度的E-选择素可能导致更严重的内皮-单核细胞相互作用。临床病例研究发现，急性期KD患者血清中可溶性形式E-选择素增加且在伴冠状动脉病变的KD 患者血清中表达更为显著。氧化磷酸化可以通过调节肿瘤坏死因子（TNF-α）刺激的内皮炎症中的核因子NF-κB 信号通路参与E-选择素的表达和内皮细胞-单核细胞相互作用，进而与活性氧（reactive oxygen species，ROS）一起参与冠状动脉内皮炎症[31-32]。由此可见，氧化磷酸化和E-选择素参与了CAL的发病机制，E-选择素可作为KD冠状动脉损伤的监测指标。

3.1.3 髓样相关蛋白8/14、S 100 钙结合蛋白A 12 Toll 样受体4（toll-like receptor，TLR-4）、RAGE 等与其在炎症部位高浓度释放的内源性配体髓样相关蛋白8/14（myeloid-related-protein-8/myeloid-related-protein-14，MRP-8/MRP-14）异源二聚结合，刺激ROS产生、激活NF-κB 通路并诱导多种促炎因子表达，损伤冠状动脉内皮完整性[33-34]，参与CAL 形成。与之相对，也有研究显示未发现MRP-8/MRP-14 与CAL 的相关性，仅发现IVIG 治疗可以抑制MRP-8和MRP-14的表达同时预防CAL发生，这可能与研究样本过小、检测技术差异及研究设计本身存在的问题有关[34]。S100钙结合蛋白A12（S100 calcium binding protein A12，S100A12）一方面可以协同MRP-8/MRP-14 通过模式识别受体RAGE 或TLR-4 介导炎症反应，另一方面可以依赖IL-1β（协同IL-1α），间接诱导内皮细胞无菌炎症反应[35]。由此可以推断MRP-8/MRP-14、S100A12相关的抑制剂可能可以作为KD 冠状动脉病变的治疗药物。

3.1.4 氧化应激 氧化应激在KD冠状动脉内皮损伤的过程中起重要作用。有关研究显示氧化低密度脂蛋白能通过凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1等清道夫受体激活NF-κB信号通路、刺激ROS生成，产生基质金属蛋白酶，诱导黏附分子、细胞因子表达和细胞凋亡，从而参与血管内皮损伤和功能障碍、平滑肌细胞迁移与增殖、动脉粥样硬化等过程[36-37]。

3.1.5 miR-223、miR-150 miR-223 通过抑制血小板衍生生成因子受体β（platelet-derived growth factor receptor β，PDGFR-β）的表达，抑制过度的血管平滑肌细胞去分化，促进血管损伤后伤口愈合[1]。此外，miR-223-3 p 还可以通过靶向IL-6 ST 阻止IL-6 表达，同时阻止STAT 3 和NF-κB p 65 信号通路激活，影响炎症因子水平，对KD内皮损伤起保护作用[16]。

miR-150 的保护作用可以从两方面进行解释。首先，miR-150 能通过抑制脂多糖诱导的TNF-α、IL-6等炎症因子并负调节NF-κB通路，从而阻断内皮细胞凋亡[38]。其次，miR-150 还能通过恢复血管内皮细胞的增殖迁移功能[21]，对CAL 起保护作用。由此可见，miR-150、miR-223 可作为KD 冠状动脉病变的潜在治疗靶点。

3.2 smad1/5-runx2通路

对干扰素诱导蛋白10和白介素17的研究发现，它们可以通过骨形态发生蛋白6（bone morphogenetic protein，BMP6）自分泌和激活smad1/5-runx2通路显著上调人VSMC中成骨基因/蛋白质（如骨桥蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶）的表达，引起冠状动脉钙化及功能失调，从而导致一系列KD 冠状动脉疾病[39]。对smad1/5-runx2通路的研究可能成为新的CAL治疗研究方向。

3.3 PI3K/ Akt通路

既往研究已证明，PI3K/Akt通路通过调节炎症、凋亡对细胞的影响，参与多种心血管疾病[40]。增强KD 中PI 3 K/Akt 通路可以通过减轻TNF-α 对内皮祖细胞增殖的抑制作用保护内皮细胞，修复血管损伤[26]。从而基因角度，敲低HDAC 2 显示可以改善PI3K-Akt信号通路磷酸化水平，从而加强VEGF转录、促进血管生成和修复的作用[26,41]。从药理学角度，麝香保心丸、葛根素、肾素-血管紧张素系统抑制剂、犀角地黄汤等研究进一步肯定了激活PI3K-Akt通路磷酸化对冠状动脉平滑肌细胞的增殖、修复作用[42-45]。综上可以认为，PI3K-Akt通路可作为CAL的治疗靶点，为新药研究提供线索。

3.4 Ca2+/NFAT通路

Ca2+/NFAT 通路是KD 冠状动脉损伤的良好干预靶点。Ca2+/NFAT是VEGF刺激内皮细胞的主要信号通路，其主要参与冠状血管的生成和静脉瓣膜的发育等过程。Ca2+/NFAT 通路特异性抑制剂环孢菌素A 通过抑制下游炎症因子表达，展现出良好的减轻内皮功能障碍疗效[32]。基因调控角度的研究则表明1,4,5三磷酸肌醇3激酶C基因可以负调节Ca2+/NEAT通路，通过磷酸化三磷酸肌醇、减少T细胞活化，对冠状动脉内皮起保护作用[3,7]。

4 结语

川崎病累及儿童冠状动脉的常见疾病。尽管发病机制尚不明确，目前已发现不少可能参与KD CAL 发病机制的保护因素，如miR-92、miR-223、MCM 蛋白、SLD 5 蛋白、PI 3 K/ Akt 通路等。此外，包括TGF-β、miR-197-3p、PWP2、PTX-3、E选择素在内的一系列损伤因素为诊断预防、IVIG疗效预测、未来新药的制备提供机制解释及新靶点。目前已经证实Ca2+/NFAT抑制剂、PI3K-Akt通路激活类药物的临床疗效。同时IncRNA、circRNA对CAL的干预可能成为未来研究热点。针对FCGR2A、MRP-8/MRP-14等研究争议还需要进一步研究。