基于荧光法生物气溶胶监测仪计数效率评价及方法研究

潘一廷，张国城，霍胜伟，田 莹，刘佳琪，杨振琪，商宇扬

(北京市计量检测科学研究院 国家生态环境监测治理产品质量监督检验中心，北京 100029)

1 引 言

随着我国经济社会的发展，生物气溶胶颗粒物污染防控对维护民生健康的重要性日益凸显。有研究表明新冠病毒存在气溶胶传播扩散风险[1～5]，其可在空气动力学直径约1～3 μm的气溶胶中保持传染性和完整性达16 h[6～8]，因此生物气溶胶引发的健康风险问题已引起广泛关注。生物气溶胶监测仪是一类能实现快速、实时监测生物气溶胶的新兴仪器[9～11]。其原理是利用光散射技术和荧光光谱技术相结合，实现对环境中发射特征波长的生物粒子进行监测。近些年，国内外已有大量关于生物气溶胶监测仪的相关研究，尤其是半导体激光诱导荧光技术在生物气溶胶监测仪上的应用[12～14]，为实时、便捷、快速地监测生物气溶胶提供了发展空间。基于荧光法生物气溶胶监测仪市场需求的爆发式增长，生物气溶胶监测仪性能评价研究成为了急需解决的问题。

目前，生物气溶胶监测评价方法基本是通过细菌产生生物气溶胶后，再利用微生物采样方法采集微生物培养[15～17]。由于微生物采样具有耗时长、预警滞后、菌的存活率以及微生物泄露等问题，不太适用于实时预警仪器的评价。针对传统方法的不足，新的评价技术也在不断发展。相对细菌微生物，荧光聚苯乙烯微球具有粒径可控，荧光性质稳定，保存时间和温度受外界条件影响小等特点，适用于生物气溶胶监测仪计数效率的评价。而且，针对生物气溶胶设备方面的标准，仅有《颗粒生物气溶胶采样和分析通则》[18]对生物气溶胶采样方式进行了介绍和规范，国内现在还没有针对该仪器的校准规范和检定规程。基于此，我们开展了针对生物气溶胶监测仪关键性能参数计数效率的评价研究，设计并搭建了1套生物气溶胶监测仪计数效率评价装置，通过制备严格单分散荧光微球，结合文丘里雾化法发尘技术对生物气溶胶监测仪荧光通道和总粒子数2个通道的计数效率评价开展了相关研究。

2 生物气溶胶监测仪组成及原理

图1 荧光法生物气溶胶监测仪原理图Fig.1 Schematic of bioaerosol monitoring instrument based on fluorescence method

荧光法生物气溶胶监测仪是基于生物本征荧光的激光诱导荧光技术(laser induced fluorescence detection，LIF)，利用激光诱导生物性物质产生特定的荧光光谱，从而完成对生物气溶胶的检测和识别，主要包括激光光源系统、光路处理系统、光电转换系统、气路系统。其中关键部件光路处理系统包括荧光通道和散射光通道(见图1)。荧光通道是利用激光诱导生物性物质发出特定波段的荧光，然后通过光电转换系统将荧光脉冲信号转换为电信号进行荧光粒子计数。散射光通道是利用激光照射粒子发生散射，形成1个光脉冲信号，然后通过光电转换系统转换成电脉冲信号进行粒径测量和总粒子计数。不是所有的分子都会发出荧光，而对于那些能够发射荧光的分子，通常需要更高的激发频率，当某些分子在跃迁的过程中被激发时便会产生荧光。生物物质中含有的氨基酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和核黄素等有机分子，可在紫外光的激发下，发射出本征荧光[19～21]。

3 实验方法

3.1 荧光微球的制备

以水/乙醇为介质，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为稳定剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，二乙烯基苯(DVB)为交联剂，70 ℃反应16～24 h，制备得到单分散交联聚苯乙烯微球(PS)。制备得到的聚苯乙烯微球通过SI-ATRP反应在PS微球表面修饰上荧光试剂得到荧光微球。具体制备过程如下：首先称取干燥的PS微球1 g置于三口烧瓶中，加入15 mL二硫化碳溶胀过夜，加入100 mmol AlCl3和100 mmol二氯丁烷，快速搅拌，50 ℃反应4 h，反应结束后依次用乙醇、冰醋酸(3%)、水清洗微球，得到含氯修饰的微球。随后配置反应液：0.01 mmol氯化亚铜，0.015 mmol多齿胺，2 mmol甲基丙烯酸缩水甘油酯和700 μL的乙醇涡旋混溶，并通入高纯氮气除去反应体系中的氧，取1 mL反应液到上述含氯修饰的聚苯乙烯微球中，一定温度聚合2～16 h。最后加入罗丹明b酰肼，通过酰肼和甲基丙烯酸缩水甘油酯上的环氧基的缩合反应制备得到荧光聚苯乙烯微球，聚合后的荧光聚苯乙烯微球用乙醇、水洗3～10次，以除去未反应的单体和其他杂质。

3.2 生物气溶胶计数效率评价

搭建的生物气溶胶监测仪计数效率评价装置组成结构如图2所示，由雾化发尘装置、洁净气流、干燥箱和混匀舱组成。使用基于文丘里原理的雾化器，该雾化器是专门针对生物气溶胶计数效率评价设计，只能发出粒径小于等于3 μm的粒子，因此极大的减少了大粒径粒子对计数结果的干扰。将聚苯乙烯微球或荧光微球混悬液从底部导入洁净气流雾化，下降过程中通过干燥气体达到稀释、干燥的目的，在混匀舱内形成浓度稳定的气溶胶。混匀舱中有两路采样口，分别放置生物气溶胶监测仪和空气动力学粒径谱仪。下方的空气动力学粒径谱仪(APS，model 3321，TSI公司，美国)也能够测量颗粒物的数量和浓度，可对舱内的气溶胶稳定性进行实时监控。

图2 生物气溶胶监测仪计数效率评价系统示意图Fig.2 Schematic diagram of counting efficiency of bioaerosol monitor evaluation system

评价时，通过调节真空泵的抽气流量和超高效过滤器流量，使得生物气溶胶采样口和动力学粒径谱仪采样口的流量相同，从而提高测量结果的准确性。式(1)为计数效率的计算方法。采样10 s后，通过将监测仪计数的颗粒物数量浓度与空气动力学粒径谱仪数量浓度相比(10 s内累计荧光粒子个数)，通过计算可得出荧光粒子计数效率：

(1)

(3)投影分带方法。UTM投影和高斯投影一样为了减少投影变形进行分带处理。UTM投影将北纬84°至南纬80°之间按经度分为60个带，每带6°，从西经180°自西向东分带，两条标准经线距中央经线为180 km左右。高斯投影从0°经线开始，采用经差6°(或3°)自西向东分带。高斯投影的第1带是UTM投影的第31带。

4 结果和讨论

4.1 荧光微球制备与表征

新型荧光聚苯乙烯微球的制备原理和流程如图3所示，首先将引发剂二氯丁烷通过傅克烷基化连接在聚苯乙烯颗粒表面，之后与甲基丙烯酰胺罗丹明(GMA-Rb)单体进行ATRP聚合反应，在聚苯乙烯颗粒表面原位生长出荧光聚合物链。该方法制备是利用罗丹明B酰肼闭环无荧光，开环有荧光的“off-on”结构，制备得到了荧光聚合物-PS杂化荧光微球，它具有严格单分散和稳定性好的优势。荧光单体通过化学键链接，解决了物理吸附制备的荧光微球在雾化过程中易出现荧光试剂脱落问题。从电镜照片可以看出，制备的PS-Rb微球球形均匀，粒径单一(参见图4右部)。而且采用的罗丹明b酰肼物质只有在酰肼和环氧基发生缩合开环反应后才有荧光，吸附上的罗丹明b酰肼试剂无荧光，这解决了有机荧光试剂在制备荧光聚苯乙烯微球时易产生物理吸附的问题。如图5(a)所示，从罗丹明b酰肼和荧光单体GMA-Rb的荧光激发光谱可以看出，罗丹明b酰肼基本没有荧光光谱峰，而GMA-Rb有明显的激发峰，在550 nm有最大激发波长。从图5(b)可以看出，在550 nm激发下，荧光微球PS-Rb在580 nm左右有最大发射波长。

图3 荧光粒子制备过程示意图Fig.3 Schematic diagram of the preparation of PS-Rb

图4 电镜图PS微球和PS-Rb微球Fig.4 SEM images of the bare PS and PS-Rb

图5 荧光光谱及荧光显微镜照片Fig.5 Fluorescence spectrum and fluorescence microscope photos

4.2 单分散荧光气溶胶

雾化发生器将荧光计数标准物质雾化后可得到粒径已知、浓度稳定的气溶胶。但是实验结果表明，商品化的荧光计数标准物质雾化以后存在大量的小粒径非样本颗粒，已超出生物气溶胶监测仪计数器的测量范围。这不仅会对仪器造成污染和损害，无法获得单分散气溶胶样品，还干扰了测量结果的准确性。推测造成这一现象的主要原因是荧光计数标准物质主要用于液体计数，溶液中含有大量的溶质，雾化过程中会将悬浮液中的部分溶质雾化干燥而形成非样本颗粒(如表面活性剂颗粒、离子等)。

研究通过表面原子转移自由基聚合法制备了用于雾化发尘的荧光微球，其荧光性质稳定，粒径均匀。该类荧光微球与溶液中的表面活性剂等溶质，在表面修饰过程中可得到很好的净化，使得雾化过程中产生的非样本颗粒数量减少，从而较为容易的得到单分散气溶胶。

4.3 生物气溶胶监测仪计数效率评价

评价监测仪计数效率前，需对计数效率评价系统进行稳定性测试。为保证混匀舱内生物气溶胶的浓度在一定时间内相对稳定，对混匀舱中气溶胶的稳定性进行了测试，将稀释流量设置为80 L/min、气溶胶流量为3 L/min、抽气流量为10 L/min。进行雾化法发尘5 min后，用动力学粒径谱仪测量混匀舱内的气溶胶浓度，为与生物气溶胶监测仪采集频率保持一致，每10 s进行1次计数，每次采集10 s内总粒子数，2 min内总粒子数采集结果如图6。

图6 混匀舱内颗粒数量浓度的稳定性Fig.6 The stability of particle number concentration in the chamber

生物气溶胶监测仪计数效率评价系统能够产生稳定浓度的单分散气溶胶粒子，对系统的稳定性测试表明，在3 min内，系统雾化产生的气溶胶粒子总粒子数的波动小于2%，满足生物气溶胶监测仪的校准和总粒子数、荧光粒子数计数效率的评价需求。

通过雾化法将粒径3 μm的PS微球和PS-Rb荧光微球形成单分散气溶胶，待混匀舱内气溶胶数量浓度稳定后，开启生物气溶胶监测仪和TSI空气动力学粒径谱仪进行采样分析，计数结果如表1和表2所示。从表1和表2中可以得出，经过校准以后，雾化3 μm PS微球形成气溶胶，总粒子通道平均计数效率可达100.7%，荧光粒子通道无计数。而3 μm PS-Rb微球雾化形成的气溶胶，总粒子数和荧光粒子通道平均计数效率可达到98.9%和98.1%。这说明制备的荧光微球能够形成单分散气溶胶，可以同时满足荧光法生物气溶胶监测仪≥0.5 μm的总粒子和荧光粒子2个通道的计数效率评价需求。

表1 3 μm PS计数结果Tab.1 Results as measured by 3 μm PS

表2 3 μm PS-Rb荧光微球计数结果Tab.2 Results as measured by 3 μm PS-Rb

5 结 论

针对生物气溶胶监测仪总粒子和荧光粒子2个通道的计数效率评价，利用SI-ATRP法制备了单分散、荧光性质稳定的荧光聚苯乙烯微球。同时采用基于雾化发尘法搭建了1套生物气溶胶监测仪计数效率评价系统，并应用于生物气溶胶监测仪计数效率的评价，2个通道的平均计数效率分别达到98.9%和98.1%。实现了生物气溶胶监测仪总粒子数和荧光粒子数计数效率的校准与评价。该研究结果为进一步深入开展相关研究提供了基础和依据。