促红细胞生成素相关通路在糖尿病视网膜病变中的发病作用机制研究进展

雷敏 胡丽丽 艾明

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的眼部并发症，已成为全球主要的致盲原因之一[1]。DR按疾病进程分为非增殖性DR（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性DR（proliferative diabetic retinopathy，PDR）两个阶段[2]。2021年国际糖尿病联合会糖尿病流行病学报告指出，近50多年来全球糖尿病的患病率呈持续上升趋势，预计到2030年将上升至10.2%[3]。《中国老年糖尿病诊疗指南》（2021年版）指出，2019年中国65岁以上糖尿病患者数约3 550万，居世界首位，占全球老年糖尿病患者的1/4[4]。研究显示，视网膜屏障的破坏、视网膜新生血管形成及视网膜神经退行性病变在DR进展中发挥着重要作用，其发病机制涉及多种调控机制和通路[5]。近年来，临床针对DR的治疗主要有抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）药物和皮质类固醇药物的玻璃体腔内注射、视网膜激光光凝和后入路玻璃体切除手术[6]，但仍然存在部分患者治疗效果不佳及视力预后不理想的情况。研究已证实，在DR发展早期，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）具有明显的血管神经保护作用[7]，PDR患者血清中EPO水平明显升高，且EPO水平与PDR临床分期呈正相关[8-9]。本文就EPO相关通路在DR中的发病作用机制研究进展作一综述。

1 EPO及其与DR的关系

EPO是一种由4个α螺旋束组成的糖基化细胞因子，属于集落刺激因子。胚胎期由胎儿肝脏产生，出生后主要由肾脏产生[10]。EPO在人体组织中广泛分布，对心脏、胃肠道、肌肉、肾脏、胰腺和神经组织等有直接影响，可靶向作用红细胞、类红细胞及其祖细胞、肿瘤细胞、免疫细胞、内皮细胞和骨髓基质细胞等[11]。EPO是一把双刃剑，近年来研究发现，生理状态下EPO对视网膜神经元、微血管内皮细胞、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞和Mller细胞具有保护功能[12]。EPO通过与EPO受体（erythropoietin receptor，EPOR）的相互结合发挥作用，有研究表明EPOR在PDR患者玻璃体中的表达水平越高预后越差，故EPOR有望作为PDR的预后生物标志物和潜在的治疗靶点[13-14]。

研究发现EPO既参与视网膜的生理性血管生成，又参与病理性血管生成[11]。研究已证实，在DR发展早期，EPO具有明显的血管神经保护作用[7]。Wang等[15]发现，EPO通过抑制甲基乙二醛的形成来降低血管生成素2（angiogenin-2，Ang-2）的表达，从而减少视网膜周细胞的丝氨酸-苏氨酸激酶磷酸化，进而抑制周细胞迁移和凋亡，预防DR早期微血管损伤，在DR早期发挥保护作用。Gu等[16]发现EPO主要通过维持谷氨酸-谷氨酰胺循环相关蛋白的正常表达，抑制高糖条件下凋亡诱导因子易位和聚腺苷-核糖聚合物形成，下调谷氨酸受体，抑制视网膜神经元过度兴奋和神经元毒性，减少神经元细胞死亡，来实现其神经保护作用。Bretz等[17]发现EPOR基因敲除小鼠视网膜的内层和外层网状层更薄，异位神经突起和b波更低，进一步证实了EPO的血管神经保护作用。另外研究显示，生理状态下玻璃体中EPO水平是血浆中的3.5倍，DR患者玻璃体EPO水平比血浆高30倍，比非糖尿病患者玻璃体内EPO高10倍[18]。PDR患者血清中EPO水平明显升高，且EPO水平与PDR临床分期呈正相关[8-9]。有学者提出，EPO具有类似于VEGF的促血管形成活性，能够刺激内皮细胞增殖、迁移和血管生成[19-20]。进一步证实，PDR患者玻璃体中EPO与VEGF明显增高，两者具有并联协调作用，它们呈正函数相关[20]，提示EPO可加剧PDR视网膜缺血和新生血管生成，从而加速PDR的进展。

2 EPO对NPDR患者视网膜的保护作用机制

2.1 磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信号通路PI3K/Akt信号通路可调节血管生成因子、促炎因子的表达及相关细胞的功能，参与多种酶生物学效应，介导正常血管及病理性血管的形成[21]。Liu等[22]研究发现，DR患者中血-视网膜内屏障（inner blood-retinal barrier，iBRB）完整性的破坏是通过VEGF/血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2）/络氨酸蛋白激酶（sarcoma，Src）信号通路磷酸化水平增加，导致血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）表达的降低诱导的，EPO可通过抑制VEGF/VEGFR2/Src信号通路，促进DR大鼠VE-cadherin的表达从而维持视网膜的屏障功能，发挥DR早期血管保护作用。Xie等[12]发现，DR大鼠视网膜中激活的小胶质细胞吞噬内皮细胞，导致脱细胞毛细血管形成，引起血管渗漏，而EPO可以提高Src/Akt/肌动蛋白素（cofilin）信号通路相关分子 Src、Akt、cofilin的磷酸化比例，抑制小胶质细胞吞噬功能，从而保护iBRB，抑制血管渗漏。先前研究已证实缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作为PI3K/Akt信号通路的关键下游蛋白，通过诱导下游蛋白质EPO的表达来阻止高糖环境下血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的破坏，同时促进营养物质和氧气转运，从而保护细胞免受缺氧损伤，抑制血管生成[23-24]。另外有学者发现EPO还可通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路，保持iBRB的完整性并减弱血管渗漏[25-26]。适量的EPO可以选择性下调IL-1β、TNF-α、IL-6、VEGF等炎症相关因子，可保护实验性DR模型BRB完整性[27]。

2.2 氧化应激通路核因子相关因子2（NF-E2-related factor，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）信号通路 Nrf2/ARE信号通路是一种普遍存在的、进化保守的信号通路[28-29]。Nrf2作为氧化应激的感受器，在抗氧化应激中起重要作用[30]。Nrf2对氧化应激高度敏感，可特异性识别并结合ARE，促进相关抗氧化基因的转录，激活血红素氧化酶（heme oxidase，HO-1）和醌氧化还原酶（quinone oxidoreductases，NQO-1），清除多余的氧自由基，减轻氧化应激损伤[31]。研究发现，EPO可过通过影响实验性DR大鼠氧化应激通路相关分子，提高Nrf2、HO-1和NQO-1的表达水平，减少超氧化物和其他自由基产生，下调谷胱甘肽过氧化物酶，降低磷酸化Akt和热休克蛋白水平，降低视网膜Ang-2表达，减少靶细胞氧化应激和亚硝化应激，从而减少DR神经细胞损伤以及周细胞的凋亡[32]。

2.3 非受体型络氨酸蛋白激酶（non-receptor tyrosine protein kinases，JAK）/信号转导和转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）信号通路 JAK/STAT信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡，在免疫反应、炎症反应及微血管内皮细胞损伤中发挥重要作用[33]。细胞实验发现，上调JAK通路后可以有效促进EPO引起的RPE胞质Ca2+内流，从而维持BRB的稳定[34]。EPO通过抑制参与JAK/STAT信号通路的分子，包括重组人B细胞淋巴瘤因子2XL（recombinant human B-cell leukemia/lymphoma XL，Bcl-xL）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）-3、Caspase-9、蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase type 2A，PP2A）、抑癌基因p53、磷酸酶基因（phosphatase gene，PTEN）和沉默信息调节因子（silent information regulator 1，SIRT1）等，抑制细胞凋亡，发挥血管神经保护作用，延缓早期DR进展[11,35]。Wang等[36]发现，EPO能有效抑制高糖介导的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGC）中Caspase-9和Caspase-3的上调，降低Bax/Bcl-2比值，从而抑制RGC的凋亡。

2.4 细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路 ERK信号通路是细胞生物学中研究最多的信号通路之一[37]，控制着许多重要的细胞生物学过程。既往研究证实，表皮生长因子通过与其受体结合后激活肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）/丝裂原活化蛋白激酶-胞外信号调节激酶（mitogen-activated protein kinase-extracellular signal-regulated kinase，MEK），激活的 MEK 使ERK磷酸化，进入细胞核影响基因转录翻译[38]。免疫组化分析证实，DR早期缺氧环境下VEGF可激活ERK的磷酸化，细胞中磷酸化ERK-1/2与总ERK-1/2的比值显著降低，调节血管通透性和细胞迁移，从而促进内皮细胞的增殖及新生血管形成，而EPO可通过逆转这一比值发挥其血管保护作用[39]。Shen等[40]发现，EPO可能通过ERK通路下调Bax，上调Bcl-2相关死亡促进因子磷酸化和Bcl-xL表达，发挥视网膜神经保护作用。锌是人体中第二丰富的微量元素，在视网膜神经纤维层、RPE和脉络膜中广泛存在，参与视网膜的多种功能，在视网膜生理和病理过程中起着重要作用，如光传导、视觉周期和神经传导等[41]。ZnT8作为锌的转运蛋白之一，可将细胞内的锌转运至细胞外，在调节细胞锌稳态中发挥着重要作用。Xu等[39]研究表明，EPO通过激活ERK通路上调ZnT8的表达，维持细胞内锌的稳态，保护高糖环境下视网膜细胞免受过量锌引起的损伤，提高细胞活力，减少细胞凋亡。

2.5 氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路 JNK蛋白是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的成员，由 MAPK8、MAPK9和MAPK10 3个基因编码，此信号通路调控多种生理过程，包括炎症反应、细胞分化、细胞增殖、细胞死亡等[42-43]。JNK信号通路由多种细胞内外刺激（如细胞因子、病原体、激素、氧化应激、DNA损伤等）激活，它们可使多种细胞质和核底物发生磷酸化，如MAPK3的磷酸化[44]。Qi等[45]通过用EPO干预敲除酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1型（tyrosine protein phosphatase nonreceptor 1，PTPN1）和 PTPN11基因编码的细胞发现，EPO可通过提高PTPN1和PTPN11的表达水平来抑制JNK信号通路，从而显著逆转高糖诱导的RGC凋亡，发挥神经保护作用。Zhang等[46]通过细胞实验发现，EPO通过阻断缺氧诱导JNK的磷酸化，上调紧密连接蛋白和闭合蛋白的表达，保护BRB，从而减少血管渗漏，延缓DR进展。

3 EPO在PDR中的发病作用机制

Samson等[35]研究显示，转染EPOsiRNA的RPE细胞中VEGF表达下调。视网膜缺氧且VEGF高表达是PDR的主要诱导因素，EPO可增强VEGF的作用，从而促进新生血管形成，使PDR进一步恶化[34，47]。Gholamhossein等[48]和He等[13]发现，PDR患者血浆EPO水平明显高于NPDR患者，EPO水平与DR分期相关，同时PDR患者视网膜增殖膜中EPOR表达显著高于视网膜静脉阻塞患者，且PDR患者术后最佳矫正视力与EPOR表达呈正相关，进一步提示EPO与PDR患者的预后相关。

4 EPO的相关应用

目前，基于靶向EPO的相关应用仍处于实验阶段，有学者发现视网膜下注射腺相关病毒介导表达人源EPO（AAV2-CMV-hEPO）的基因，可使血清中具有生物活性的EPO蛋白增加，从而发挥其血管神经保护作用[49]。EPO衍生的肽ARA290[50]、氨甲酰化EPO（CEPO）[47]通过抑制RGC及小胶质细胞凋亡和延缓血管退行性病变，使实验性DR大鼠的视网膜电图b波振幅和振荡电位下降，从而发挥血管神经保护作用。Li等[51]通过对5例DR患者行EPO玻璃体腔注射，发现短期内疗效可观，但存在样本量较少的局限性。因此，携带EPO基因或其他特定基因的AAV2载体有望成为DR长期预防或辅助治疗的潜在治疗方式，但EPO在DR中的临床应用仍然需要大量的临床试验来验证。

5 小结

DR是糖尿病的常见并发症，可引起不可逆的视网膜损伤。EPO作为一种糖基化细胞因子，在DR发展早期具有明显的血管神经保护作用。在PDR中，可导致病理性血管的生成以及BRB的破坏，加剧PDR的进展。在DR发病机制中EPO所参与的各种信号通路并不是孤立存在的，往往存在多个信号通路间的协同作用。近年来，针对DR虽然有非常成熟的治疗方式，如抗VEGF药物和皮质类固醇药物玻璃体腔注射、视网膜激光光凝、玻璃体切除术等，但仍然存在大部分DR患者出现治疗效果不佳以及预后不理想的情况。DR发病机制中EPO相关信号通路的不断探索为DR的治疗提供了更多潜在的靶点，这些发现对延缓DR进展以及治疗具有非常重要的临床意义。