低蛋白饲粮添加氨基酸对黔北麻羊血液代谢和瘤胃发酵参数的影响

■安 靖马政发韩 娥杨 艺吴文旋*陈鑫珠

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，动物科学学院，动物营养与饲料科学研究所，新农村发展研究院，贵州省山地畜禽养殖污染控制与资源化技术工程实验室，贵州贵阳 550025；2.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建省畜禽遗传育种重点实验室，福建福州 350013）

随着畜禽养殖业的快速发展，导致蛋白质饲料资源匮乏日益加剧，如何提高机体对蛋白质的利用效率、减少环境的污染已成为科学研究和实际生产中更加重视的问题，深受学界和养殖界的关注。氨基酸是构成蛋白质的原料，合理的氨基酸水平及各氨基酸之间的平衡性极大程度地影响饲料的蛋白质利用率。基于蛋白质和氨基酸营养平衡提出的低蛋白质氨基酸饲粮，能够在饲粮粗蛋白（CP）水平降低的同时含有最佳的氨基酸组合，节约饲料蛋白质资源，提高畜禽对蛋白质的吸收利用效率，已在科学研究和生产实践中取得良好的反馈；低蛋白日粮为低于参照《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）中生长育肥山羊的营养需要配制的基础日粮。文献报道，在低蛋白质饲粮中补充氨基酸可以提高鸡的生长性能和抗氧化能力[1-2]；同时也可提高猪的蛋白质利用率、改善肉品质，还不影响生长性能[3-4]。

赖氨酸（Lys）和蛋氨酸（Met）作为第一、二限制性氨基酸，是氨基酸和低蛋白质研究上优先考虑的高位限制性氨基酸，对反刍动物的蛋白质营养调控具有重要作用。由于单胃动物和反刍动物对营养物质的消化与吸收方式存在着明显区别，游离氨基酸（小肽）经小肠吸收之前会被瘤胃微生物降解，导致营养损失，因此生产上常使用过瘤胃技术来保护这两种必需氨基酸，以取得更好的营养效果。据文献报道，向荷斯坦公牛日粮中添加过瘤胃赖氨酸（RPLys）15 g/d与过瘤胃蛋氨酸（RPMet）30 g/d可在一定程度上提高其生长性能，增加机体蛋白质的合成和氨基酸沉积，表明添加RPLys和RPMet能够在一定程度上替代部分饲粮粗蛋白[5]。当荷斯坦公牛饲粮蛋白质水平从13%降低至11%时，向饲粮中补充55 g/（d·头）RPLys+9 g/（d·头）RPMet 不影响生长性能、养分消化率、屠宰性能及肉品质，并可改善肌肉中氮代谢相关基因的表达[6]。就目前研究看，在牛的低蛋白日粮中添加过瘤胃赖氨酸（RPLys）与过瘤胃蛋氨酸（RPMet）的适宜添加量报道较多，在羊的研究上鲜有报道。

作为贵州独有的三大优良地方山羊品种之一，黔北麻羊主产于我国赤水河流域习水县境内，品种特征明显，2009 年被认定为新的山羊遗传资源品种，学术研究价值独特，贵州省还单独成立了黔北麻羊产业园区。但目前而言，有关黔北麻羊资源调查、遗传育种、基因测序、繁殖率等方面的研究报道较多，而针对低蛋白日粮的文献较少，不利于提升黔北麻羊养殖技术水平和产业化开发。据此，本课题组前期完成了在饲粮中单一添加RPMet[7-8]、RPLys[9]的研究，目前鲜见二者同时添加是否会产生协同作用效果的研究报道。本试验探讨在低蛋白质饲粮中同时添加RPLys、RPMet 对黔北麻羊的生长性能、血液生化指标和瘤胃发酵参数的影响，为推行低蛋白质饲粮在黔北麻羊的生产中使用提供数据支持和参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验采用单因素随机区组试验设计，选用18只年龄相近、初始体重为（41.15±2.27）kg的健康黔北麻羊（贵州地方品种山羊）羯羊为试验动物，分为3个处理组：对照组、处理Ⅰ组、处理Ⅱ组，每个组6只羊（n=6）。对照组山羊饲喂基础饲粮（CP=12.49%），不添加过瘤胃氨基酸（RPAA）；处理Ⅰ组CP水平在基础饲粮上降低2%，CP 为10.25%，添加0.5%的RPLys 和0.2%的RPMet；处理Ⅱ组CP 水平与处理Ⅰ组一致，添加1.0%的RPLys 和0.4%的RPMet。RPLys 和RPMet 的过瘤胃率均为85%（杭州康德权饲料有限公司），其中赖氨酸和蛋氨酸的有效含量分别为50%和75%。RPLys 与RPMet 的添加比例参照课题组前期研究[7-9]加以探讨，通过调配豆粕水平来调节日粮CP水平。

1.2 试验饲粮与饲养管理

试验基础饲粮参照《肉羊饲养标准》（NY/T 816—2004）中生长育肥山羊的营养需要配制，其组成及营养水平见表1，实测值略高于设计值。试验羊按重复单笼饲养，依照羊舍常规程序进行定期消毒与驱虫，保证圈舍干净卫生整洁及良好通风环境。整个试验期持续21 d，包含预试期14 d，采样期7 d。试验羊饲喂方式为将RPLys、RPMet 与精料混合均匀后依照先精后粗的原则饲喂，试验期间每日09：00 和18：00 饲喂两次，随时观察试验羊采食情况，以剩料不低于5%的原则适当增减料，自由采食，自由饮水。

表1 试验饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 生长性能

在试验开始第1天和试验最后1天对晨饲前的试验羊空腹称重，记录为始重（IBW）和末重（FBW），试验期间饲喂前称每只羊的剩余料，试验结束后统计并计算每只试验羊的干物质采食量（DMI）、平均净增重（ANG）、平均日增重（ADG）。

1.3.2 饲粮营养成分

试验开始后，每3 d 采用四分法采集所饲喂的饲粮样品，将收集的饲粮样于（65±2）℃烘箱中烘干，粉碎过1 mm筛制成分析试样，装入自封袋保存，用于后续测定试样的总能（GE）、粗蛋白（CP）、有机物（OM）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量，参照《饲料分析及饲料质量检测技术》测定[10]。

1.3.3 血液生化指标

试验在正试期第6 天晨饲前空腹条件下对所有试验羊颈静脉采血，805 r/min 离心15 min，将离心后的血浆分装至1.5 mL EP 管中，-20 ℃条件下保存待测。采用全自动生化分析仪（BS-360S，Mindray）测定血浆总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总氨基酸（TAA）、尿素氮（PUN）、尿酸（UA）、肌酐（Cr）、碱性磷酸酶（AKP）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）含量，所用试剂盒购于深圳迈瑞科技有限公司。根据试剂盒操作步骤测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量，检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，检测仪器为Thermo 酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）。

1.3.4 瘤胃发酵参数

正试期第7 天，试验羊饲喂后，通过胃管式瘤胃液采样器（VP 30，北京莱伯泰科）间隔4 h经由试验羊口腔抽取3次瘤胃液（采集时间分别为09：00、13：00、17：00），分别测定瘤胃液pH（PHS-3C便携式pH计），然后用4层无菌纱布过滤，并在4 000 r/min条件下常温离心10 min后分装于10 mL离心管中，-20 ℃冰箱中低温保存，后续测定氨态氮（NH3-N）浓度[11]、纤维素酶活性、挥发性脂肪酸（VFA）浓度[12-14]。

1.4 数据处理与分析

数据均以“平均值±标准差”表示。采用SAS 9.4统计软件的ANOVA过程对3组试验数据进行单因素方差分析，运用Duncan’s 法多重比较检验差异的显著性，P＜0.05表示数据差异显著。

2 结果与分析

2.1 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet对山羊生长性能的影响

如表2 所示，低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet 均不影响山羊的生长性能，各组间各项指标均无显著差异（P＞0.05）。

表2 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys与RPMet对山羊生长性能的影响

2.2 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet对山羊血液生化指标的影响

由表3 可见，处理Ⅰ组和处理Ⅱ组PUN 水平接近，分别较对照组低24.77%和24.95%，均显著低于对照组（P＜0.05）。低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys与RPMet 对其余生化指标影响较小，各组之间TP、ALB、TAA、UA、Cr、AKP、AST、ALT、SOD、GSH-PX、MDA、CAT均无显著差异（P＞0.05）。

表3 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys与RPMet对山羊血液生化指标的影响

2.3 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet对山羊瘤胃发酵参数的影响

由表4、表5可知，低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet 对山羊的瘤胃发酵参数无影响，各组之间瘤胃pH、NH3-N 浓度、纤维素酶活性、VFA 浓度均无显著差异（P＞0.05）。

表4 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys与RPMet对山羊瘤胃pH、NH3-N浓度及纤维素酶活性的影响

表5 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys与RPMet对山羊瘤胃挥发性脂肪酸的影响

3 讨论

3.1 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet对山羊生长性能的影响

动物的生长和生产主要依赖饲粮中营养物质的需要供给和吸收情况，而蛋白质是反刍动物生命活动中最重要的承担者之一，蛋白质水平和各种氨基酸平衡都是影响生产性能的关键因素[15]。单独降低饲粮的CP 水平必然会导致蛋白质与氨基酸的供应量减少，而营养物质的摄取不足将直接降低动物的生长和生产性能[16]。因此在对反刍动物研究和使用低蛋白质饲粮时，需要额外添加一定的必需氨基酸，用以维持氨基酸的平衡以及促进蛋白质的合成。由于饲粮中精料主要原料组成的不同，Lys 和Met 均可能是反刍动物的第一或第二限制性氨基酸，都影响着机体其他氨基酸的利用效率和平衡情况。有研究指出，在正常饲粮中补充RPLys 和RPMet 能够提高动物的生长效率[17]。而高岩等[18]在荷斯坦公牛基础和低蛋白质饲粮上补充RPLys 和RPMet 发现，ADG 和F/G 不受影响，具有良好的饲养成本和经济效益，生产上添加RPLys 和RPMet 来代替一定量的蛋白质饲料具有可行性。韩云胜等[5]研究发现，在不含RPAA 的基础饲粮中添加RPLys 和RPMet 可提高荷斯坦奶公牛的FWB 和ADG，降低F/G，其中以添加RPLys 30 g/d 和RPMet 15 g/d的效果最好。但本试验结果显示，在低蛋白质饲粮中补加RPLys 和RPMet 并不会影响山羊的生长性能，添加两者产生的协同效应仅可获得与基础饲粮相似的生长性能，无法产生更理想的效果。猜测是由于本试验的试验动物为地方品种，所选的生长阶段和体重对于生长发育而言已经相对稳定，受RPAA的影响较小。

3.2 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet对山羊血液生化指标的影响

3.2.1 血浆代谢指标

血液是动物体内各种营养物质和代谢产物的关键运输载体，通过测定血液的各项指标能够反映出饲粮在体内的利用情况以及营养需要量，在价值评定和营养调控动物的生长性能和健康状况上有着重要的作用。TP和ALB具有调节血浆渗透压和pH变化、提供机体所需要的蛋白质、运输体内营养代谢物质的重要功能，是监测机体氨基酸摄入和蛋白质合成代谢状态优先考虑的主要指标参数；TAA是血液中氨基酸含量的总和，可以用来评价饲料蛋白质在动物机体内的分解和代谢吸收情况；Cr水平的高低能够反映出动物肌肉组织的代谢情况，若Cr水平明显高于正常值，则表明动物肾脏组织受到一定的损伤，需要及时地进行调控治疗；PUN 是蛋白质分解代谢的产物，与蛋白质合成代谢和氨基酸之间平衡有关[19]，PUN可衡量动物机体蛋白质代谢水平和饲粮氨基酸平衡状况，与动物机体氮沉积相关[20]。本试验中，两个处理组血浆PUN水平显著低于对照组，提示低蛋白质饲粮饲喂RPLys和RPMet能提高饲粮蛋白质利用率。UA作为动物机体蛋白质、氨基酸和核酸的代谢产物，能够清晰地反映出蛋白质的营养水平和分解代谢能力，而提高体内蛋白质的合成量会引起UA水平的下降。Rajwade等[21]在犊牛基础饲粮中添加RPLys 和RPMet，发现TP、ALB 含量不受影响，PUN 含量显著降低。有研究指出，低蛋白质饲粮添加RPLys和RPMet会引起梅花鹿幼鹿血清PUN、UA 水平明显下降，但TP、ALB 浓度不受影响[22]。本试验中，UA、TAA、ALB、Cr 水平差异不显著，与上述研究类似。这充分表明低蛋白质饲粮添加RPLys 和RPMet 能促进蛋白质和其余氨基酸的合成利用，达到和基础饲粮一样的代谢效果。

AST、ALT 和AKP是机体氨基酸代谢过程中的关键酶，有助于反映动物的生长和发育状况，是研究中用来评价肝功能的首选指标。其中ALT 和AST 主要在氨基酸和糖代谢过程中发挥着关键作用，当肝脏组织器官出现病变或受损的现象时，两种酶的浓度会偏高[23]；AKP 广泛存在于生物界和动物脏器中，在生物磷代谢过程中具有重要作用，有益于皮肤细胞的新陈代谢及再生[24]。正常条件下，降低饲粮的CP 水平必然会引起氨基酸和蛋白质分解代谢和合成作用减弱，ALT、AST 和AKP 水平也会随之出现变化，最终会加重动物肝脏的负担。低蛋白质饲粮中补充一定含量的Lys 和Met 能够提高氨基酸的组成比例和数量，促进体内的氨基酸平衡，减少不必要的氨基酸转氨基代谢，提高氨基酸的利用效率，很大程度上能够改善蛋白质的合成代谢和机体的营养缺陷。本试验在降低饲粮CP 水平的同时添加一定水平的RPLys 和RPMet不会引起ALT、AST 和AKP 水平的改变，不影响山羊的肝脏功能，这与其他研究结果相一致[25-26]。

3.2.2 血浆抗氧化应激能力

当动物受到刺激时，细胞的抗氧化防御和促氧化反应就会处于代谢紊乱状态，机体本身清除体内氧自由基的能力极度不足，引起机体组织代谢产生与沉积大量的氧自由基，使细胞和组织受到不同程度的损伤，这种非正常的生理现象被称为氧化应激反应，容易对动物的生理机能和生产性能造成严重的危害。SOD、GSH-PX、CAT、MDA 是评价机体抗氧化系统动态平衡情况的主要参数，能够反映出动物的健康状况。SOD是机体主要清除超氧阴离子自由基并防止细胞遭到损伤的关键抗氧化酶；CAT则是细胞催化过氧化氢分解成氧和水的工具酶。通过提高二者在动物体内的水平可以防止发生过氧化反应和生成不受控的自由基，有利于机体抗氧化。GSH-Px具有清除机体内的脂质过氧化物的作用，是保护机体组织重要的抗氧化酶。MDA 是动物组织细胞脂质经过氧化反应生成的主要产物，它的水平能够判断脂质的过氧化程度以及细胞受损情况。目前关于氨基酸代谢对机体的抗氧化系统的影响研究各存差异。有研究指出，围产期饲喂RPLys 可降低奶牛的血浆MDA 水平，对增强GSH-Px的活性有积极作用[27]。奶牛在热应激条件下添加蛋氨酸羟基类似物异丙酯[2-hydroxy-4-（methylthio）butanoic acid isopropyl ester, HMBi]降低了血浆中MDA的水平，提高了SOD 和GSH-Px 的含量[28]。但王群[29]发现，不同CP水平的饲粮添加HMBi均不会引起奶牛血清中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的变化，在肉羊上添加不同的蛋氨酸产品也得出类似结论[30]。本试验发现，各组试验羊之间血浆SOD、GSH-Px、MDA 和CAT没有差异，表明低蛋白质饲粮添加RPLys和RPMet时，对机体的抗氧化性能没有显著影响。

3.3 低蛋白质饲粮添加不同水平的RPLys 与RPMet对山羊瘤胃发酵参数的影响

瘤胃发酵是瘤胃微生物降解饲粮中营养物质和合成反刍动物所需营养物质这一过程的总称，饲粮中的营养物质进入体内主要是供给瘤胃微生物吸收利用，而反刍动物最主要和最高效益的营养物质利用主要依托于瘤胃微生物的菌体蛋白质、糖类和脂类。研究中常用瘤胃pH、NH3-N 浓度、纤维素酶活性、VFA浓度等参数来反映饲粮营养物质消化程度和动物的健康情况。

饲粮组成和营养水平是影响瘤胃pH 的关键因素，瘤胃pH 的高低对瘤胃微生物繁殖和瘤胃发酵有着主导作用，制约着饲粮营养物质的吸收利用和反刍动物的反刍行为和生长功能，较为正常的pH 范围一般为5.7～7.5。瘤胃NH3-N 是饲粮中蛋白质、氨基酸及其他非蛋白氮受瘤胃微生物分解的产物，也是微生物蛋白合成的必需物，NH3-N浓度过高会以尿素的形式代谢排出，过低则不宜于瘤胃微生物蛋白的合成。Abbasi 等[31]研究表明，低蛋白质饲粮补充RPMet 不会影响山羊的瘤胃pH。Tamura 等[32]研究发现，早期泌乳母牛的基础饲粮上补饲8 g/d的RPMet并不会引起瘤胃pH和NH3-N浓度的显著变化。王剑飞等[33]在奶牛瘤胃的体外发酵试验上也发现类似结果。本试验研究结果与上述报道一致，各组的瘤胃pH 均处在正常范围内变化（6.88～7.07），瘤胃NH3-N浓度也无显著差异，表明降低饲粮的CP 水平并添加RPLys 和RPMet，山羊的瘤胃发酵与基础饲粮的作用效果一致，瘤胃内环境稳态和蛋白质的分解吸收不受影响。

反刍动物能够消化粗饲料中约50%的纤维物质，这主要是由于瘤胃内微晶纤维素酶、羟甲基纤维素酶、木聚糖酶和纤维二糖酶等多种纤维素分解酶种的存在，因此常把它们作为活性参数来反映饲粮中纤维物质的降解程度。吴文旋课题组前期发现，低蛋白质饲粮中添加RPLys 或RPMet 对不同时间点的瘤胃纤维素酶活性都没有明显影响，不会引起瘤胃微晶纤维素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶及羧甲基纤维素酶活发生显著变化[7-9]。本试验结果与以上研究类似，可能是由于少量的Lys和Met即使影响瘤胃纤维降解菌的活性，但影响甚微并不能达到显著水平。

VFA是饲粮中纤维、淀粉等营养物质在瘤胃微生物消化分解作用下的产物，具有给反刍动物提供能量和维持正常的瘤胃内环境的功能，它的浓度能够较为准确地反映出瘤胃发酵模式和微生物活性的变化情况[34]。Lee 等[35]在泌乳奶牛饲粮中补饲蛋氨酸羟基类似物，发现丙酸、丁酸及戊酸浓度下降，乙丙比有所提高，TVFA浓度没有变化。吴文旋课题组前期在基础饲粮中补充RPMet发现，山羊的VFA没有显著变化，瘤胃微生物对蛋白质、碳水化合物的发酵不会受影响[7-8]。牛骁麟[36]在CP水平为14.0%的基础饲粮中添加RPLys和RPMet，发现对TVFA、乙酸、丙酸、丁酸、乙丙比均无显著影响。本试验中，低蛋白质饲粮组合添加RPLys和RPMet不影响瘤胃的VFA浓度，与前人研究一致。其原因可能是：①瘤胃中VFA的产生量与采食量有直接的关系，当以饲喂粗饲料为主时，采食量对VFA 产生的摩尔比例影响较小，当饲喂精料条件下，采食量的增加会引起乙酸比例的下降，丙酸的比例增加，本试验中3组饲粮的精粗比例一致，且各组采食量之间差异不显著，因此VFA 不受RPAA 的影响；②同时VFA 主要是通过瘤胃微生物降解饲粮中纤维素及半纤维素产生的，RPAA由于经过包被处理，即使少量的RPAA流入瘤胃内也不会引起纤维素及半纤维素降解活动发生实质性改变，因此不会引起VFA 发生变化。

4 结论

在山羊的饲粮CP水平从12%降低至10%的条件下，补充RPLys 和RPMet 可降低血浆PUN 水平，不会对其他血液生化指标、抗氧化应激能力、瘤胃发酵产生负面影响。在本试验条件下，向低蛋白质饲粮中添加RPLys和RPMet的适宜量为0.5%和0.2%。