苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠卵巢功能的影响

刘志可, 王 朗, 顾梦影, 陆彩玲, 薛 健*,

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.国家卫生健康委科学技术研究所 遗传优生中心，北京 100081)

苯醚甲环唑 (difenoconazole) 是三唑类杀菌剂中的常用品种，用于防治小麦 (条纹锈病[1]、麦瘟病[2]等)、苹果树 (赤霉病[3]等) 及葡萄 (如灰霉病[4]) 等多种作物上的病害，应用范围广泛。近年来，食品安全抽检结果显示，苯醚甲环唑在香蕉[5]、韭菜[6]等多种食用农产品上存在残留超标现象，其在香蕉上的残留量达2.83 mg/kg，高于相应的最大残留限量 (MRL，1 mg/kg)[7]，对人体可能存在膳食暴露风险。本课题组前期对不孕女性63 对血清和卵泡液样本中的农药残留情况进行了筛查，发现除了常被检出的持久性有机氯类农药外，苯醚甲环唑的检出率也较高 (数据未发表)。因此，苯醚甲环唑膳食暴露是否会对女性生殖系统产生影响值得进一步探讨。

卵巢的主要功能是分泌甾体激素和排卵，其中孕酮 (P) 和雌二醇 (E2) 是卵巢分泌的主要甾体激素。原始卵泡的数量在雌性哺乳动物中是一定且不可再生的[8]，其数量决定了卵巢的储备功能[9]。已有研究表明，苯醚甲环唑对斑马鱼和青鱂鱼卵巢会产生不利影响[10-11]。由于哺乳动物的毒性物质暴露方式与水生生物存在较大差异，因此采用更合理的毒理学评价方法评估农药暴露对哺乳动物卵巢的影响非常必要。亚急性暴露[12]在毒理学中常被用于研究重复暴露于某种毒性物质对机体的影响。本研究拟通过苯醚甲环唑对雌性SD 大鼠进行连续28 d 亚急性暴露处理，初步探究苯醚甲环唑亚急性暴露对大鼠卵巢功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

21 日龄雌性SD 大鼠，体重 (67 ± 6) g，从北京维通利华实验动物技术有限公司购入，于中国医学科学院药用植物研究所动物房[SYXK (京)2017—0020]分笼饲养，每笼3～4 只，饲养室温度22～25 ℃、光/暗周期12 h/12 h，可自由饮水和取食。实验相关处置均符合动物福利要求，通过中国医学科学院药用植物研究所伦理委员会批准(审批号：SLXD-20220510021)。

1.2 主要试剂及仪器

苯醚甲环唑 (difenoconazole) 原药粉末 (顺反式混合物，纯度99.4%，普西唐(天津)生物科技有限公司)；玉米油 (北京索莱宝科技有限公司)；大鼠雌二醇 (Rat E2) ELISA 试剂盒及大鼠孕酮(Rat PROG) ELISA 试剂盒 (上海酶联生物科技有限公司)；氨基甲酸乙酯 (又名乌拉坦，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。Tecan Spark 酶标仪(瑞士TECAN 公司)；DM2500/DM2500LED 徕卡正置生物光学显微镜 (德国Leica 公司)；CP225D十万分之一电子天平 (德国Sartorius 公司)。

1.3 给药剂量设置

本研究以苯醚甲环唑在各类可食用农产品中的MRL 值[7]和日膳食量 (dietary intake)[13]为基础，计算出成人的膳食暴露量，换算成大鼠的等效剂量[14]为1.25 mg/(kg bw • d)。考虑到作物上普遍存在的农药残留超标现象和长期膳食摄入的慢性农药积累，按照风险最大化原则，本研究提高了给药剂量，以充分反映受试物的潜在毒性效应，并结合亚急性毒性试验剂量的设置方法[15-16]，将试验剂量分别设置为膳食暴露量的40、80 和160 倍，即50、100 和200 mg/(kg bw • d)，分别为相应LD50值[17]的1/40、1/20 和1/10。

1.4 动物给药方式

将苯醚甲环唑溶于玉米油中进行灌胃给药。精确称取一定量苯醚甲环唑原药粉末于50 mL 离心管中，加入一定体积的玉米油，于20 ℃超声溶解20 min，同时上下晃动以助混匀，待完全溶解后配制得到质量浓度为12.5、25 及50 mg/mL 的苯醚甲环唑玉米油溶液，于室温 (25 ℃) 下避光静置保存。参考NY/T 2873—2015《农药内分泌干扰作用评价方法》[18]设置不同质量浓度苯醚甲环唑玉米油溶液的给药体积为4 mL/kg bw，对照组给予等体积的玉米油。每组10 只大鼠。于每天上午同一时间对大鼠进行灌胃处理，连续灌胃28 d。灌胃期间每日称重，并注意观察大鼠精神、黏膜、毛发及自主活动等外观状态。

1.5 血清及脏器取材

染毒处理结束后，于大鼠发情间期取材。大鼠称重后，以5 mL/kg bw 的剂量腹腔注射20%氨基甲酸乙酯进行麻醉，取腹主动脉血于5 mL 真空采集管中，室温静置2 h 后，于3500 r/min 下离心10 min，吸取上层血清至1.5 mL 离心管中，于-80 ℃保存。取血完成后，摘取大鼠的卵巢、肝脏、肾脏等组织，剔除脏器周围附着的脂肪组织等，经生理盐水润洗后用滤纸吸干表面，称重并计算脏器系数。称重后，迅速将小块肝、肾组织和一侧卵巢分别放入固定液中固定。

1.6 血清中孕酮和雌二醇水平测定

采用酶联免疫分析法[19]对血清中雌二醇及孕酮水平进行测定，具体操作按照试剂盒使用说明书进行。

1.7 卵巢中各级卵泡计数

随机选取每组中的6 只大鼠，将其卵巢组织进行石蜡包埋、最大面切片和苏木精-伊红 (HE)染色后，于显微镜 (200 倍) 下观察卵巢皮质中的不同类型卵泡并计数。卵泡的分类标准[20-21]：原始卵泡 (颗粒细胞为单层扁平状)；初级卵泡 (颗粒细胞为单层立方形)；次级卵泡 (有多层颗粒细胞，无明显卵泡腔)；窦卵泡 (有多层颗粒细胞，且有明显的卵泡腔)；闭锁卵泡 (可见退化的卵母细胞等异常情况)；黄体 (体积大，血管丰富)。其中，初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡为生长卵泡[22]。

1.8 数据处理

试验数据采用平均值 ± 标准差表示。单因素方差分析，结合图基 (Tukey) 检验进行事后多重比较。采用GraphPad Prism9.0 软件进行差异显著性分析，P＜0.05 为具有统计学意义差异。

2 结果与讨论

2.1 苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠常规指标及脏器系数的影响

药剂灌胃处理期间，大鼠精神、黏膜、毛发及自主活动等外观状态均正常；各组大鼠体重均呈增长趋势；对照组及中、高剂量处理组大鼠分别死亡1、1 和2 只。灌胃结束后，对照组及低、中、高剂量处理组大鼠体重分别增加 (137.2 ± 16.3)、(138.6 ± 14.5)、(140.9 ± 16.1) 和 (136.5 ± 9.7) g，各时间段内，给药组大鼠体重变化与对照组相比均无显著性差异 (P＞ 0.05)。低剂量和中剂量处理组大鼠肝脏脏器系数和对照组相比无显著差异，高剂量处理组比对照组显著升高 (P ＜0.01)；各剂量给药处理组大鼠卵巢脏器系数与对照组相比无显著性差异 (P＞ 0.05) (图1)。朱丽秋等[23]关于苯醚甲环唑的亚慢性经口毒性研究发现，药剂处理组大鼠肝脏和肾脏的脏器系数均显著升高。本研究中观察到肝脏脏器系数显著升高，但未观察到给药组和对照组肾脏脏器系数的差异，推测这可能是由于染毒时长不同造成的。本研究中肝脏和肾脏经HE 染色后观察发现：给药组大鼠肝细胞发生水肿和空泡化病变，其中200 mg/(kg bw • d)高剂量处理组大鼠肝脏细胞空泡化现象最为严重，100 和200 mg/(kg bw • d) 剂量给药组大鼠肝脏组织出现炎细胞浸润现象；给药组大鼠肾脏肾小管上皮细胞发生水肿；而对照组肝、肾组织均未见明显异常。研究表明，在所设置的剂量和暴露时间下，苯醚甲环唑亚急性经口暴露会对大鼠肝脏和肾脏组织产生一定损伤。

2.2 苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠血清中孕酮和雌二醇水平的影响

孕酮和雌二醇是卵巢分泌的甾体激素，雌二醇可以促进卵泡的生长和排卵，刺激子宫内膜增生和血管形成以及维持月经等，孕酮则维持着卵巢月经周期和妊娠等多种正常功能[24]。酶联免疫分析结果 (表1 和图2) 表明：200 mg/(kg bw • d)高剂量暴露组大鼠血清中雌二醇水平高于低、中剂量组和对照组，但差异不显著 (P＞ 0.05)，其原因可能是由于苯醚甲环唑暴露上调了雌激素合成过程中关键基因的表达[25]。和对照组相比，200 mg/(kg bw • d)高剂量暴露组血清孕酮水平显著升高 (P＜ 0.01)；50 和100 mg/(kg bw • d)暴露组与对照组相比则无显著差异，但均显著低于高剂量暴露组 (P＜ 0.05)。Teng 等[11]针对水生动物的研究表明，雌性斑马鱼持续21d 暴露于0.5～500 mg/L 的苯醚甲环唑溶液后，其体内催化孕烯醇酮转化为孕酮的基因 (3-βHSD) 表达量升高。这可能也是本研究中给药组血清孕酮水平升高的原因。

表1 不同剂量苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠血清孕酮和雌二醇水平的影响Table 1 Effects of subacute oral exposure to different doses of difenoconazole on serum progesterone and estradiol hormone levels in rats

图2 不同剂量苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠血清中孕酮和雌二醇水平的影响Fig.2 Effects of subacute oral exposure to different doses of difenoconazole on serum levels of progesterone and estradiol in rats

2.3 苯醚甲环唑亚急性经口暴露对大鼠卵巢卵泡发育的影响

各类卵泡的数量和占比统计分析结果 (表2)显示：200 mg/(kg bw • d)高剂量暴露组大鼠生长卵泡的比例与对照组相比显著升高 (P＜ 0.05)，50 和100 mg/(kg bw • d)暴露组生长卵泡占比也均高于对照组，但无显著性差异 (P＞ 0.05)；3 个剂量给药组原始卵泡的占比虽然与对照组相比无显著性差异，但均呈降低趋势；各剂量给药组黄体和闭锁卵泡占比与对照组均无显著差异 (P＞0.05)。研究表明，苯醚甲环唑可能是通过促进原始卵泡向初级卵泡发育进而消耗原始卵泡的数量，从而降低卵巢储备，影响卵巢的正常功能[26]。

表2 不同剂量苯醚甲环唑亚急性经口暴露后大鼠卵巢中各类卵泡占比 (%，N = 6)Table 2 Percentage of various types of follicles in rat ovaries after subacute oral exposure to different doses of difenoconazole (%，N = 6)

3 结论

本研究表明，200 mg/(kg bw • d)剂量苯醚甲环唑亚急性经口暴露会对大鼠卵巢产生毒性影响，该暴露剂量下可导致大鼠血清孕酮水平和生长卵泡比例升高；50 mg/(kg bw • d)暴露剂量下则未观察到对大鼠卵巢显著的毒性作用。本研究可在一定程度上为评估苯醚甲环唑对动物的生殖毒性提供参考。