了解临床微生物检验的常用染色方法

李玉梅

微生物细胞含有大量的水分（通常在80%以上），对光线的吸收和反射与水溶液差别不大，与周围背景没有明显的明暗差。所以，除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，绝大多数情况下都要经过染色后，才能在显微镜下进行观察。但是，染色就意味着微生物处于死亡状态，其形态、结构也会发生一些变化，并不能完全代替活细胞的真实状况。

基本原理

微生物染色通常有化学和物理两种方法。其中，物理方式通常采用渗透、染料吸附等，化学方法则利用染料与细胞物质进行化学反应。通常来说，酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样，碱性物质对酸性染料较易于吸附。但是，要使酸性物质染上酸性材料，必须把它们的物理形式加以改变（如改变pH值），才利于吸附作用的发生。细菌的等电点较低，呈现出酸性。因此，一般细菌学经常会使用碱性染料染色。染色还可能与菌体结构、膜的状况（通透性、孔大小等）、细胞结构，以及染色时的电解质、温度等有一定关系。

染料

染料分为人工和天然两种。天然染料存在于自然界当中，例如苏木素、胭脂虫红等，通常提取于植物当中。人工染料一般在煤焦油当中获得，属于苯衍生物。染料通常为有机酸或碱类，在有机溶剂当中易溶解，水中难溶解，但可以制成盐类而溶于水。染料还可分为酸性、碱性、中性、单纯四大类。

其中，酸碱染料并不是依据溶液的pH值决定，而是其自身所带的助色基团决定。将助色基团电离之后，查看电荷的带电情况。通常而言，碱性染料助色基团为正电荷，酸性染料助色基团为负电荷。因此，碱性染料通常能电离无色阴离子和有色阳离子，如龙胆紫、亚甲基蓝等；酸性染料通常能电离一些无色阳离子和彩色阴离子，如伊红、苦味酸、加那绿等。中性染料是一种复合型染料，通常是将酸碱染料进行混合。单纯染料通常亲和力低，染色的能力通常由被染色物决定，若能够较好地溶于被染色物当中，则染色能力强，且单纯染料难以溶于水，可溶脂肪溶剂，例如紫丹类。

微生物染色程序

虽然微生物有许多染色方式，但一般的操作程序大体相同，通常的流程为制片—干燥—固定—染色—干燥—镜检。

（1）制片：在进行微生物染色前，制作相应的载玻片。操作时，将生理盐水滴1滴在载玻片上，而后应用无菌接种环挑选少许培养物混入生理盐水中研磨至均匀乳浊状，再涂抹成直径1.5 cm左右的椭圆形薄菌膜。如果是液体培养基中的菌液，可直接涂在载玻片上。（2）干燥：涂片通常是在室温当中进行自然干燥。为加快干燥速度，可以将菌膜面向上放在酒精灯火焰上方进行微加热，使水分快速蒸发，但应注意不能够与火焰靠得太近，否则会使菌体出现变形而影响镜下观察。（3）固定：通常是将细胞的结构进行固定。杀死微生物，将菌体与载玻片牢牢相粘，防止水冲洗掉。固定时需要将载玻片来回几次通过酒精灯火焰最外层，温度以玻片不烫手背为宜，冷却之后进行染色。（4）染色：根据检验目的不同，选择不同的染色方法，染液应完全覆盖菌膜。（5）干燥：染色冲洗完成后的涂片可自然晾干，也可用吸水纸吸水后晾干或烘干。（6）镜检：应用光学显微镜在油镜下对菌体的染色性、形态、排列进行观察。

微生物染色方法

通常，微生物有单染和复染两种染色方法 。

单染

即用一种染料对涂片进行染色，简单方便，适用于观察微生物的形态，但是不能够对微生物进行鉴别。常用碱性染料，如亚甲基蓝、孔雀石绿、碱性品红、结晶紫、中性红等。如果使用酸性染料，通常使用刚果红、伊红、藻红和酸性品红。当使用酸性染料时，必须降低染料溶液的pH值，使其呈强酸性（低于细菌细胞的等电点），使细胞带正电，从而容易被酸性染料染色。

比如棉蓝染色是一种用于真菌检验的染色方法。首先在一个干净的载玻片上，滴入1～2滴乳酸酚棉蓝染液，然后应用解剖针将霉菌菌落边缘地区含有孢子及菌丝的部分切割取下，放置于染色液当中，盖上盖玻片稍用力按压（注意不要产生气泡），放至显微镜下进行观察。先使用低倍镜，再换高倍镜。在镜下，真菌孢子和菌丝会呈现出蓝色，利于观察真菌完整的形态。

复染

复染是应用两种及以上的染料进行染色的方法。

革兰氏染色

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。其被用于对肺炎链球菌以及克雷伯菌进行鉴定，包括了四个步骤，初染—媒染—脱色—复染。未染色的细菌在显微镜下很难分辨，因为与周围环境的折射率相差不大。在染色后，阴性菌为红色，阳性菌为紫色，然后再对于细菌的整体形态和结构进行观察，以初步鉴定细菌的种类。

具体操作：首先使用接种环蘸取细菌，均匀涂抹于加有生理盐水的载玻片上；对载玻片背面加热杀死细菌并固定粘附，应用紫色染液进行初染色，时长为1 min左右；應用自来水冲洗多余的染料后，应用碘液媒染，持续1 min后进行冲洗；应用脱色剂脱色，例如95%酒精、丙酮酸，持续30 s，阳性菌在这一过程中不变色，阴性菌变为无色；应用红色染液复染，持续30 s，阴性菌变为红色。

这一方式的原理为在对细菌应用紫色染料初染以及碘溶液媒染后，细菌的细胞壁当中会形成结晶紫碘络合物，其物理性质不溶于水。阳性菌的细胞壁厚，肽聚糖非常紧密，在应用脱色剂进行脱色时，阳性菌失水出现收缩，不容易脱色，且不含脂类物质，在乙醇处理时没有空隙，所以呈现为紫色。而阴性菌的细胞壁薄，结构并不紧密，同时含有大量脂质，在脱色时脂肪溶解，结构变得更为松散，故非常容易脱色，呈现无色；在应用红色染料进行第二次染色时，着色呈现为红色。

抗酸染色

抗酸染色法是一种对具有抗酸性的细菌进行检查的特殊染色方法。如分枝杆菌这类抗酸细菌的细胞壁含有大量脂质，不容易被着色，需要进行加热或延长染色时间才能着色。若一旦与染料进行结合后，很难被酸性的脱色剂脱色。该染色方法首先使用石炭酸复红进行初染；然后使用盐酸酒精脱色；最后用亚甲蓝染液进行复染。

具体操作：首先将石碳酸复红染液滴加在涂片上，可用玻片夹将涂片固定在火焰的高处进行加热，待出现蒸汽后短暂移开（若是染液蒸发减少，可以进行添加，避免干涸）；当染液冷却后，可再加热。如此循环10 min后，将标本冷却水洗。不进行加热染色时，可将染色时间延长至20 min，随后应用3%的盐酸酒精进行脱色至涂片无色为止，再使用自来水进行冲洗，最后使用亚甲蓝染液复染1 min，水洗，自然待干或用吸水纸吸干后进行镜下观察。

可见，单染和复染两种染色方式存在着较大的区别。单染只染一种颜色，一般应用于对菌体的形态和排列方式的观察，但不能够对细菌进行鉴别。复染应用的染料较多，因菌体的结构组成不同呈现出不一样的颜色，且不同的细菌种类也存在不同的染料反应，因此能够鉴别细菌，在临床应用也较多。