基于超高效液相色谱-质谱技术及网络药理学和分子对接探讨柴芍胃炎颗粒治疗慢性胃炎的有效成分及潜在作用机制

唐定洪 李能源 任维 梁盼 罗群 黄锐 蒲清荣 赵剑 任桂林

[关键词]柴芍胃炎颗粒；超高效液相色谱-质谱；胃炎；网络药理学；分子对接

慢性胃炎（chronicgastritis，CG）指不同病因引起的各种慢性胃黏膜炎性病变，临床上以上腹部疼痛、饱胀、烧灼感、反酸嗳气、食欲不振等症状多见，是一种常见病，“十人九胃病”，据世卫组织统计，胃病的发病率高达80%，且日趋年轻化，故而胃病已成世界之殇。而CG位居胃病之首，病情反复，影响患者生活质量，甚至导致胃癌的发生。在我国，基于内镜诊断的CG患病率在90%左右[1]。

胃病的病机多为胃气阻滞，胃失和降，不通则痛。若情志不畅，肝郁气滞，肝胃不和，损伤脾胃，而中焦升降失调，运化不利，则胃脘部胀痛，故胃病与肝密切相关[2]。故将CG的病机概括为肝郁、胃热、脾虚，治疗以疏肝、清热、补虚为主[3]。柴芍胃炎颗粒是西南医科大学附属中医医院（我院）医疗机构制剂，由柴胡、黄连、吴茱萸、白芍、莪术、丹参、延胡索、酒大黄、黄芪、木香等中药制成，其中柴胡疏肝解郁，白芍柔肝止痛，黄连、吴茱萸清肝胃郁热，木香行气止痛，延胡索、丹参、酒大黄活血化瘀，黄芪补气健脾，诸药共奏疏肝和胃，清热止痛的功效[4]，用于肝胃不和、肝胃郁热所致的胃脘胀痛、灼痛嗳气、口干口苦、情志不畅加重等症[5]。柴芍胃炎颗粒在我院已使用多年，临床疗效显著，但作用机制仍不清楚。本研究借助网络药理学及分子对接对柴芍胃炎颗粒治疗CG的成分及靶点进行预测，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

Ultimate3000超高效液相色谱仪，美国Waters公司；LTQOrbitrapvelospro高分辨质谱仪，美国ThermoFisher公司。柴芍胃炎颗粒，西南医科大学附属中医医院制剂室，批号：20211115。

1.2 色谱及质谱条件

色谱条件：Hss-T3色谱柱（1.8μm，2.1mmID×150mm，Waters）；35℃柱温；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱：0～5min，2%B；5～8min，2%B→20%B；8～38min，20%B→55%B；38～45min，55%B→70%B；45～50min，70%B→80%B；50～56min，80%B→100%B；56～58min，100%B；58～58.5min，100%B→2%B；58.5～65min，2%B；流速0.2ml/min。质谱条件：电喷雾（ESI）离子源，加热器温度300℃，毛细管温度350℃，毛细管电压35V，喷雾电压为±3.5kV，鞘气（N2）流速35arb，辅助气（N2）流速10arb；一级质谱正负离子模式全扫描，m/z扫描范围100～1500，二级质谱数据依赖性扫描。

1.3 样品的制备

取柴芍胃炎颗粒10g，加8倍量的水，超声30min，过滤，滤液12000r/min离心20min，取上清液，即得供試品。

1.4 柴芍胃炎颗粒活性成分检索及靶点预测

检索中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/）获取柴芍胃炎颗粒中每味中药的化学成分，以口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18作为条件筛选活性成分。在TCMSP中筛选出候选活性成分的靶点信息[6]。将靶点信息导入Uniprot数据库统一基因名称。

1.5 胃炎相关靶点的搜集

以“gastritis”“chronicgastritis”“chronicsuperficialgastritis”为检索关键词，分别通OMIM（https：//omim.org/），Drugbank（https：//go.drugbank.com/），DisGeNET（https：//www.disgenet.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库获取胃炎的相关靶点[7]。

1.6 “中药-有效成分-治疗靶点”网络图的构建

将化学成分的靶点与胃炎疾病的靶点取交集，作为柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的潜在作用靶点。将化学成分的靶点与潜在治疗靶点相互映射，构建“中药-有效成分-治疗靶点”网络[8]，并导入Cytoscape3.8.0进行可视化，计算网络中节点的拓扑参数，筛选重要的化合物及作用靶点。

1.7 蛋白相互作用网络的构建

将潜在作用靶点上传到STRING11.0数据库（https：//www.string-db.org/），构建蛋白相互作用网络（PPI），并将此网络导入Cytoscape3.8.0进行可视化，筛选重要的蛋白质[9]。

1.8 功能富集分析

应用R及Rstudio软件对柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的潜在作用靶点的生物过程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）、细胞成分（cellcomponent，CC）和KEGG通路富集分析，运用KEGG数据库（www.kegg.jp）绘制靶点作用通路，进一步揭示柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的作用机制[10]。

1.9 分子对接

通过pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载化学成分结构（.sdf），PDB（http：//www.rcsb.org/）数据库下载靶点的结构。用DiscoveryStudio软件分别对靶点结构进行去除结晶水、加氢等处理，将PPI中Degree值前10的靶点与“中药-有效成分-治疗靶点”网络图中Degree值前15的化学成分进行对接，以libdockscore值作为对接程度的评判标准。

1.10 中药-归经网络的构建

通过检索《中华人民共和国药典》2020年版[11]，对柴芍胃炎颗粒中的中药归经进行整理，构建柴芍胃炎颗粒中药-归经网络图。

2 结果

2.1 柴芍胃炎颗粒主要化学成分

将柴芍胃炎颗粒供试品按照上述条件进行UPLC-HR-MS分析，利用XcaliburQualBrowser软件及文献鉴定化合物，图1为正、负离子检测模式下的柴芍胃炎颗粒色谱图，成分鉴定结果见表1。

2.2 柴芍胃炎颗粒活性成分及对应靶标

通过检索TCMSP数据库并筛选，得到柴芍胃炎颗粒候选活性化合物249个，其中白芍7个、柴胡11个、大黄6个、丹参54个、党参13个、莪术1个、甘草86个、黄连9个、黄芪16个、木香5个、吴茱萸24个、延胡索49个、枳壳5个，共有成分19个。对活性成分进行靶点预测，获取靶点303个。

2.3 “中药-有效成分-治疗靶点”网络

利用OMIM、Drugbank、DisGeNET、GeneCards数据库获取胃炎的相关靶点共计2060个。将成分靶点与疾病靶点取交集，共有134个交集靶点。将上述结果构建“中药-有效成分-治疗靶点”网络，见图2。图中共有396个节点（中药13个、成分249个、靶点134个），其中菱形代表治疗靶点，上方圆形的代表共有化学成分，其余则代表中药及各自中药的化学成分。对节点拓扑参数进行分析，筛选网络中关键的节点，Degree值在前10位的化合物分别是：槲皮素、木樨草素、山柰酚、川陈皮素、柚皮素、β-谷甾醇、芒柄花黄素、异鼠李素、甘草查尔酮A、丹参酮ⅡA，这些成分作用于胃炎的潜在靶点较多，说明这些成分与胃炎的靶点关系密切。Degree值在前10位的靶点分别是：PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、AR、NOS2、PPARG、CHRM3、ESR2、F2、GSK3B，说明柴芍胃炎颗粒治疗胃炎与这几个靶点相关性较大。

2.4 PPI网络的构建

将134个交集靶点导入STRING数据库，得到蛋白质间的相互作用信息，除了COA7靶点，其余靶点均具有相互作用。其Degree值较高的靶点为AKT1、IL6、TNF、TP53、IL1B、CASP3、JUN、PTGS2、MMP9、STAT3，其值分别为104、104、102、99、95、92、92、88、87、87。见图3。

2.5 靶点富集通路分析

由GO富集分析结果可知，柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的作用靶点主要涉及的生物过程包括对脂多糖的反应，对细菌源性分子的反应，活性氧代谢过程和对氧化应激的反应等。分子功能主要包括细胞因子活性，DNA结合转录因子结合等。细胞组分主要涉及膜筏，膜微区等结果见图4。KEGG富集分析P值最小的通路为脂质与动脉粥样硬化通路，见图5，在该通路中，浅色靶点代表该通路中最为关键的靶点。

2.6 分子对接

运用DiscoveryStudio软件对靶点和化学成分进行分子对接，筛选对接分数值最高的靶点和其对应的化学成分，木犀草素、吴茱萸次碱、山柰酚等化学成分与靶点对接值较高，靶点中PTGS2、CAPS3等靶点对接分数值最高，其中PTGS2与木犀草素、吴茱萸次碱、山柰酚对接分数值达到了130，分子对接图见图6，表明这几个分子具有的潜在作用活性强。

2.7 中药-归经网络的分析

中药-归经网络图中有11味中药均归脾经，有8味中药归肝经，有6味中药归胃经，可见柴芍胃炎颗粒的主要作用部位在脾、肝、胃，这与柴芍胃炎颗粒的功效主治一致，见图7。

3 讨论

本研究借助网络药理学，初步探讨了柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的作用机制。分子对接的结果表明PTGS2与木犀草素、吴茱萸次碱、山柰酚对接分数值较高，起主要作用。PTGS2、PTGS1又分别名为COX-1、COX-2，是花生四烯酸转化为前列腺素代谢中的关键酶。PTGS1参与前列腺素的成分生成，特別是在胃和血小板中，是胃上皮细胞产生前列腺素和血小板产生血栓素A2（TXA2）的关键步骤。PTGS2在平滑肌及绝大多数被生长因子、细胞因子或激素刺激的组织中表达，负责产生炎症性前列腺素，参与细胞生长、PG的产生等生物过程。通过降低PTGS2的表达起到抗炎作用[16]。因此，柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的靶点主要与抗炎、细胞增生等机制相关。

本研究运用超高效液相色谱-串联质谱技术、网络药理学和分子对接的方法，对柴芍胃炎颗粒的多成分-多靶点的复杂网络关系进行探究，初步阐释了柴芍胃炎颗粒治疗胃炎的作用机制，为探索药效物质基础和作用机制提供了方向。