接种4种外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗生长、光合及养分含量的影响

戴伟红，邹 锋，江 盈，左荣花，田诗义，殷慧敏，熊 欢

（中南林业科技大学 林学院/经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004）

【研究意义】板栗（Castanea mollissima）属壳斗科（Fagaceae）栗属（CastaneaMiller）植物，其坚果美味可口，营养价值高，素有“铁杆庄稼”“木本粮食”之美誉[1-2]。发展板栗产业，对于推动山区绿色经济和乡村振兴具有重要的意义[3]。目前，我国板栗仍处于大田实生苗嫁接良种的繁殖阶段，移栽定植过程中起苗易伤主根，加之板栗主根再生能力较弱[4]，苗木质量不能得到有效保障。在丘陵山地造林存在缓苗期长、苗木生长慢等问题，如何培育优质板栗苗木以适应瘠薄的山地亟待解决。经研究表明，菌根化育苗可提高苗木生物量、苗木质量和山地造林成活率，增强其抗逆性[5-6]。菌根化育苗技术是实现菌根在林业中应用的技术关键。板栗是外生菌根真菌宿主植物，探究不同外生菌根真菌对板栗幼苗生长的影响，对板栗优势菌种筛选及菌根化育苗技术应用具有现实意义。【前人研究进展】菌根（mycorrhiza）是指土壤中真菌与高等植物根系形成的一种互惠互利的共生体（mutualistic symbiont）[7]。世界上约有10%的植物能形成外生菌根，大多为乔木树种，主要有松科（Pinaceae）、柏科（Cupressaceae）、杨柳科（Salicaceae）、桦木科（Betulaceae）、壳斗科（Fagaceae）等34科100余属的植物[8]。对杉木（Cunninghamia lanceolata）、辽东栎（Quercus liaotungensis）、红锥（Castanopsis hystrix）及台湾相思（Acacia confusa）等其他林木的研究表明，接种外生菌根真菌具有促进林木幼苗存活[9]、养分吸收与生长[10-11]、抗逆特性[12]等方面的多重生态功能。接种外生菌根真菌通过显著提高宿主植物的光合作用效率，从而提高碳水化合物在植物体内的积累，实现幼苗的快速生长。然而，一些用幼苗和幼树的试验也表明，因菌根提高的光合作用可能不总能补偿菌根对碳水化合物的需求，而导致明显较矮小的外生菌根植株[13-14]。这个效果不仅和与宿主植物共生的真菌种类相关，也和宿主植物的营养状态相关[15]。因此，像“适地适树”一样，应提倡“适树适菌”，不能盲目使用菌根真菌[16]。【本研究切入点】目前，关于板栗接种外生菌根真菌研究主要集中在我国北方[17-19]，然而关于接种外生菌根真菌对湖南主栽品种‘檀桥’板栗幼苗生长的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】因此，本研究以‘檀桥’板栗家系苗为材料，设置4个不同菌种的接菌处理，以不接菌为对照，通过测定和分析其菌根侵染率、生长（苗高、地径、生物量、根系）、光合指标及植株氮、磷、钾养分含量，研究接种不同外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗生长的影响，筛选出促生作用较好的外生菌根真菌，以期为南方丘陵山地板栗菌根化育苗技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

‘檀桥’板栗，该品种具有果大、色亮、淀粉含量高，香甜可口，具有高产、稳产、抗性强等特点[20]。试验材料为‘檀桥’板栗家系苗，其种子由中南林业科技大学栗种质资源圃提供。种子消毒：播种前采取水浸法进行选种，利用多菌灵（含量50%）消毒20 min、无菌水冲洗2～3 次后，于4 月下旬播种。供试基质∶由黄心土∶草炭土∶珍珠岩∶蛭石=6∶4∶2∶1 的体积比混合制成。基质消毒：将五氯硝基苯（含量为40%）稀释10 倍后均匀喷洒供试基质，并用塑料薄膜覆盖3 d。打开薄膜后，将基质翻匀摊开晾晒，7 d 后装入16 cm×30 cm（口径×高）的盆中用于播种。5月中旬，待板栗幼苗第一对真叶展开后[21]，选择整齐一致的苗木进行接种。

1.2 外生菌根真菌及培养

供试菌种如表1，由课题组前期分离、鉴定所得[22]。液体菌剂制作：选用MMN 固体培养基[23]，对真菌进行平板培养后，分别切取1 片菌饼放入经灭菌的装有150 mL MMN 液体培养基的三角瓶中，置于摇床上（25 ℃、180 r/min）振荡培养1个月。固体菌剂制作：将泥炭土∶蛭石=9∶1的体积比混合后，装入10 cm×20 cm 组培瓶中，于高压灭菌锅中120 ℃灭菌20 min，灭两次。每瓶固体基质倒入约50 mL 液体菌剂后，于25 ℃暗培养30 d，即可备用[24]。

表1 供试菌种Tab.1 The tested strains

1.3 试验设计

设置5个水平，分别为：不接种（CK）、接种LY-8、LY-9、LY-17-2和MB，每15盆为1个小区，每种处理重复4次，共计300株苗，各小区之间间隔0.5 m。采用品字形接种于幼苗近根部土壤，每盆接种30 g固体菌剂。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 菌根侵染率 在9 月中旬，即接种4 个月后，取根系非木质化的部位，将其剪成1 cm 长的根段，随机取100根段，用培养皿置于体式显微镜（Olympus SZX16）下，用观察统计法测定菌根侵染率[25]。菌根侵染率=侵染成功的菌根根段数/总根段数×100%。每个处理随机选择10 株苗木，单株为1 次重复。

1.4.2 苗木生长指标测定 从6月到11月，连续每月用卷尺和游标卡尺测定其苗高和地径，每个处理随机选择20 株幼苗。待11 月苗高地径调查结束后，用电子天平称量单株苗木地上部和地下部鲜重，然后将地上部和地下部分别于105 ℃杀青30 min，60 ℃烘干至恒重，称取地上部和地下部干重[26]。根据生物量计算苗木质量指数[27]：苗木质量指数=苗木总干物质量（g）/[苗高（cm）/地径（mm）+茎干物质量（g）/根干物质量（g）]。每个处理随机选择10株幼苗，单株为1次重复。

1.4.3 根系形态观测 于11月，取各处理的地下部，利用根系扫描仪（Epson expression 11000XL）扫描图像，运用Win-Rhizo 根系分析仪软件分析根总长、根系总表面积、根平均直径、根体积和根尖数[28]。每个处理随机选择10株幼苗，单株为1次重复。

1.4.4 光合参数和叶绿素含量测定 在8 月中旬，定于晴天09：00—11：00，使用Li-6400XT 便携式光合仪测定净光合速率、蒸腾速率，并计算水分利用效率（水分利用效率=光合速率/蒸腾速率），并采摘其叶片进行叶绿素含量测定[29]。每个处理随机选择5株苗木，每株选择成熟的功能叶3片，重复测定3次。

1.4.5 养分含量测定 于11 月，分别将根、茎、叶烘干后粉碎，各称取0.3 g 经硫酸-双氧水消化后，采用自动间断分析仪（Smart chem200）测定氮、磷，火焰光度计（Model 410）测定钾[30]。每个处理随机选择10 株苗木，单株为1次重复。

1.5 数据统计

使用Excel 2010软件对原始数据进行整理，采用IBM SPSS statistics 26.0对数据进行显著性分析。不同处理之间试验参数显著差异性采用单因素方差分析（One-way ANOVA）中的邓肯氏检验（Duncan’s test，P＜0.05），运用Origin 2019软件进行绘图。采用皮尔森法（Pearson）分析苗木质量指数与苗木根、茎、叶中氮、磷、钾养分吸收的相关性[24]。

2 结果与分析

2.1 ‘檀桥’板栗幼苗根系的侵染情况

接种LY-8、LY-9、LY-17-2 和MB 后，均观察到根尖膨大，菌根为黄色或白色，并有外延菌丝，而CK未形成外生菌根（图1A，图1B，图1C，图1D）。然而，不同外生菌根真菌接种‘檀桥’板栗幼苗后，其菌根侵染率有显著差异（图1F）。其中，LY-17-2的侵染率最高，达86.40%；其次是MB，为73.17%；而LY-8与LY-9的侵染率差异不显著。

图1 不同外生菌根真菌接种板栗幼苗后形成的菌根共生体形态及侵染率Fig.1 Morphology and infection rate of mycorrhizal symbionts formed by different ectomycorrhizal fungi inoculating Castanea mollissima seedlings

2.2 外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗生长的影响

接种4 种外生菌根真菌的‘檀桥’板栗幼苗苗高和地径均高于对照，且差异显著（P＜0.05，图2），较对照分别增加19.81%～32.74%和17.89%～24.80%。在6月至11月期间，接种MB 的幼苗苗高生长速度最快且最大为51.33 cm，其次是LY-17-2，苗高为48.67 cm（图2A）；接种LY-8 的幼苗地径生长速度最快且最大为6.14 mm，其次是MB，地径为5.98 mm（图2B）。

图2 不同外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗苗高（A）和地径（B）的影响Fig.2 Effects of different ectomycorrhizal fungi on seedling height（A）and ground diameter（B）of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

由表2可以看出，接种4种外生菌根真菌的‘檀桥’板栗生物量均高于对照，且差异显著（P＜0.05），其接菌苗较对照分别提高了78.75%、71.47%、95.50%、86.36%。并且，接种处理均能显著提高‘檀桥’板栗地上和地下部分的鲜重、干重。其中，接种LY-17-2 效果最好，生物量最大12.61 g/株，苗木质量指数也最大，为1.44，且地上鲜重、干重较对照分别增加57.97%、73.88%；地下鲜重、干重较对照分别增加72.81%、122.81%。

表2 不同外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗生物量的影响Tab.2 Effects of different ectomycorrhizal fungi on the biomass of Castanea mollissima‘Tanqiao’ seedlings

2.3 外生菌根真菌对板栗幼苗根系构型的影响

接种LY-8、LY-9、LY-17-2和MB的‘檀桥’板栗根系总长度、表面积、体积、平均直径、根尖数均高于对照，且除了平均直径，其他均差异显著（P＜0.05，表3，图3）。接种处理与对照相比，根系长度分别增加183.68%、126.25%、143.31%、141.11%；表面积分别增加216.69%、156.91%、190.39%、176.29%；根系体积分别增加235%、160%、197.25%、146.25%；根系平均直径分别增加16.36%、21.82%、21.82%、16.36%；根尖数分别增加157.60%、107.49%、121.60%、131.61%。并且，从总根长、表面积、体积、根尖数来看，接种LY-8效果最好，其次是LY-17-2。

图3 不同接菌处理‘檀桥’板栗幼苗的根系形态Fig.3 Root morphology of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings under different inoculation treatments

表3 不同外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗根系生长参数的影响Tab.3 Effects of different ectomycorrhizal fungi on root growth parameters of Castanea mollissima‘Tanqiao’seedlings

2.4 外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗光合、蒸腾速率、水分利用效率和叶绿素含量的影响

接种4 种外生菌根真菌的‘檀桥’板栗幼苗净光合速率较对照明显升高，且差异显著（P＜0.05，图4A），其中接种LY-17-2 的幼苗净光合速率最高，为6.51 µmol/（m2·s），较对照高131.67%。接种LY-8、LY-17-2 和MB 的幼苗蒸腾速率较对照相比明显降低，且差异显著（P＜0.05，图4B）。对于水分利用效率，接种LY-8和LY-17-2‘檀桥’板栗幼苗较对照显著（P＜0.05，图4C），分别提高263.16%和612.03%。

图4 不同外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗叶片光合速率（A）、蒸腾速率（B）和水分利用率（C）的影响Fig.4 Effect of different ectomycorrhizal fungi on Pn（A），Tr（B），and WUE（C）in the leaves of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

接种4种外生菌根真菌的‘檀桥’板栗幼苗叶绿素a含量、叶绿素b含量和总叶绿素含量均高于对照，且差异显著（P＜0.05，图5）。接种后，其幼苗叶绿素a含量明显增加，增幅在12.05%～55.42%。其中，接种MB 后，叶绿素a 含量最大为1.29 mg/g（图5A）。接种后，其幼苗叶绿素b 含量也明显增加，增幅在41.67%～208.33%。其中，接种LY-8 后，叶绿素b 含量最大为1.11 mg/g（图5 B）。并且，接种LY-8 后，叶片总叶绿素含量较对照增加最多，为100.85%（图5 C）。

图5 接种不同外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗叶片叶绿素a含量（A）、叶绿素b（B）含量和总叶绿素含量（C）的影响Fig.5 Effects of different ectomycorrhizal fungi on chlorophyll a content（A），chlorophyll b content（B）and total chlorophyll content（C）in leaves of Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

2.5 外生菌根真菌对‘檀桥’板栗幼苗养分积累的影响

接种外生菌根真菌促进了‘檀桥’板栗幼苗养分的积累（图6）。接种苗的根、茎、叶中N 元素含量均高于对照，且有显著差异（P＜0.05，图6A）。与对照相比，接种后根、茎、叶中N 的百分含量分别提高了5.97%～22.84%、12.83%～21.32%、13.80%～20.56%，且接种LY-17-2 效果最佳。接种也导致了‘檀桥’板栗幼苗根、茎、叶中P 含量的升高且差异显著（P＜0.05，图6B），尤其是根中P 含量提高了192.86%～350.00%，其中接种MB 的根P 含量最高，为0.63 g/kg；其次是LY-17-2，为0.52 g/kg。从对K 的影响看，接种对叶片中的K 含量有显著影响（P＜0.05，图6 C），而对茎和根中的K含量并无显著影响。

图6 不同接菌处理对‘檀桥’板栗幼苗积累N（A）、P（B）、K（C）的影响Fig.6 Different inoculation treatments on N（A），P（B）and K（C）accumulation by Castanea mollissima ‘Tanqiao’ seedlings

2.6 苗木质量指数与N、P、K线性回归分析

苗木质量指数与根、茎、叶的N、P和叶中的K呈显著正相关，与根、茎中的K无显著相关性（图7）。对于氮积累，根、茎、叶中的相关系数分别是0.51（P＜0.01），0.47（P＜0.01）和0.52（P＜0.01）（图7A，图7B，图7C）。对于磷积累，根、茎、叶中的相关系数分别是0.63（P＜0.001），0.42（P＜0.01）和0.45（P＜0.01）（图7D，图7E，图7F），其中根中的P极显著（P＜0.001）。对于钾积累，叶中的相关系数分别是0.41（P＜0.01）（图7I）。

图7 苗木质量指数（SOI）与根、茎、叶中氮、磷、钾养分积累的相关性Fig.7 Correlation between seedling quality index（SOI）and accumulation of nitrogen，phosphorus and potassium in roots，stems and leaves

3 讨论与结论

豆马勃属和硬皮马勃属的外生菌根真菌是壳斗科植物的常见共生真菌[22,24,28,31]。然而，不同菌种对不同林木或同种林木的侵染率及共生效应均有显著差异[32-35]。本研究供试的4种外生菌根真菌在接种4个月之后，均能成功侵染‘檀桥’板栗幼苗的根系形成菌根，且菌根侵染率均超过60%。其中，接种Sclerodermasp.1（LY-17-2）的侵染率显著高于接种其他真菌，达86.40%。

苗木质量指数（SQI）是综合评价苗木质量的重要形态指标之一，SQI＜1.0的是低质量的幼苗，而SQI＞1.0是高质量的幼苗[36]。本研究发现接种4种外生菌根真菌均能显著提高SQI，将低质量的‘檀桥’板栗幼苗（未接种SQI=0.76）培育成高质量苗木（接种LY-17-2 的SQI=1.44），在锥栗（C.henryi）上接种Sclerodermasp.也得到类似的结果[24]。通过SQI的计算公式可知，其与苗木根系干质量成正比。本试验研究发现，接种4种外生菌根均能显著提高‘檀桥’板栗幼苗的根系干质量和根系构型指标。这与用其他外生菌根真菌侵染锥栗和欧洲栗（C.sativa）上得到的结果类似，即接种外生菌根真菌主要促进了苗木根系发育[37-38]。与其他3 种真菌相比，接种LY-8 在总根长和根尖数上有更明显的促进作用。植物根系是吸收养分的主要器官，总根长增加和根尖数的增多有助于提升根系对氮、磷、钾养分的吸收利用[24]。且接种LY-8 和LY-17-2 根部氮的积累显著高于LY-9 和MB，而氮是叶绿素的重要组成元素之一，导致接种LY-8叶绿素含量显著高于其他3种。

与未接种相比，接种苗的光合作用速率显著增加，这与欧洲栗、板栗等菌根化的研究结果一致[39-40]。可能由于外生菌根真菌生长对碳水化合物的需求，刺激幼苗提高光能转化效率[14]。此外，通过相关性分析，发现苗木质量指数与根、茎、叶的N、P 和叶中的K 呈显著正相关，特别是根中的P 极显著。大量研究表明，P 是酸性红壤地区限制林木生长的关键因子[41-42]，接种苗更加发达的根系及菌丝网络，有利于对土壤中矿质养分元素（特别是P）的吸收[43-44]。然而，接种苗和未接种苗中除了叶片中的K有显著差异，其茎和根中的K 含量并无显著性差异，可能是由于植物不同器官或组织的营养和能量需求不同[45]，而K 在茎和根中积累处于相对平衡的状态，因此接种外生菌根真菌对K在茎和根中的积累无显著影响。

综上所述，接种4种外生菌根真菌扩大了根系，促进了植株对养分的积累，提高了光能利用率，最终促进了‘檀桥’板栗幼苗的生长。经过综合比较，接种LY-8和LY-17-2对‘檀桥’板栗幼苗促生效果最好。

致谢：湖南省教育厅重点项目（21A0180）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！