生防菌剂链霉菌JD211对水稻土壤微生物群落结构及碳代谢的影响

彭海龙，徐天宇，钟秉峰，李 涛，孟丽媛，魏赛金*

（1.江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045；2.江西农业大学 应用微生物研究所，江西 南昌 330045）

【研究意义】近几十年来，人们为促进作物生长免受病虫害干扰，会过度使用化肥和杀菌剂，这种做法不仅会造成化肥残留，危害人畜的健康，而且在有效杀害病原菌的同时还会杀害其他有益微生物，破坏土壤生态平衡[1]。生物防治作为一种绿色、可持续发展的病虫害防控方法，强调生态环境和人类健康的良性循环和发展[2]，可通过有益微生物定殖于土壤来抑制土传病害，同时促进植物的生长。其中，具有抑菌性潜力的植物内生菌已被广泛用于土壤病害的防治，如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克氏菌属(Burkholderia)、链霉菌属(Streptomyces)、木霉属(Trichoderma)以及菌根真菌(mycorrhizal fungi)，这些内生菌可以通过抗生、竞争、溶菌、重寄生、诱导植物产生抗病性和优化土壤结构来抑制病原菌的生长[3]。【前人研究进展】链霉菌是一种革兰氏阳性细菌，它的孢子可以直接与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的菌落相互作用而转移到植物组织中[4]。Abbasi 等[5]在蔬菜温室土壤中施加生防菌剂，发现链霉菌IC10对番茄枯萎病的防治比施用多菌灵提高了12.5%。马云艳等[6]研究发现，在棉田土壤中施用黄三苏链霉菌(Streptomyces flavotricini)和棉秆炭的组合，可以改变土壤中优势微生物的数量和比例，增强土壤防病促生作用。

【本研究切入点】水稻土是我国重要的耕作土壤，约占全国作物耕地总面积的1/5，其在农业系统固碳过程中发挥着不可或缺的作用[7]。土壤有机碳(SOC)是最大的陆地碳库，在稳定土壤肥力、缓解气候变化和维持微生物代谢方面发挥重要作用[8]。土壤有机碳含量可能会受微生物代谢调控，Bouskill等[9]认为土壤呼吸向大气中排放CO2可能是土壤有机碳分解主要过程，Bastida等[10]也认为任何严重失衡的微生物群落关系都可能会加快土壤有机碳的消耗，但土壤微生物群落对碳循环的影响仍然存在争议。在前期的研究中，课题组从珙桐植株中分离得到一株奈良链霉菌(Streptomyces naraensis），命名为链霉菌JD211。该菌株对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、葡萄炭疽病和烟草黑胫病等土传病害具有较强的抑制作用，制成生防菌剂施用于土壤还能促进水稻幼苗的生长[11]，但其对土壤微生物群落结构和代谢活性影响尚不清楚。【拟解决的关键问题】本研究以不加菌剂的水稻土为对照，添加不同浓度链霉菌JD211，采用气相色谱和Biolog-ECO 方法分析生防菌剂对水稻土壤微生物活性、碳源利用能力以及微生物群落组成的效应，旨在明确链霉菌JD211 对水稻土壤微生物群落结构和代谢活性的影响，以期为其在农业生防应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验所用土壤采自江西农业大学水稻试验田（28°46′22″N，115°49′57″E）的表层（0～20 cm）。选取5个点采集土样，将样品风干后混匀，研磨过筛网（2 mm）。土壤质地为粉壤土（黏土28.5%、粉土56.2%、沙土15.3%），土壤堆积密度（BD）1.12 g/cm3、pH 5.58、总氮（TN）1.67 g/kg、有机碳（SOC）13.71 g/kg。

链霉菌JD211生防菌剂采用固态发酵[11]，低温烘干后粉碎过筛（0.25 mm），活菌数为2.5×108cfu/g，有机碳含量为16.23 g/kg。

1.2 土壤培养试验

根据菌剂与土壤质量比设置3 个处理，分别为0%（CK）、2%（B2）和4%（B4），每个处理3 个平行。在500 mL玻璃瓶中装入100 g风干土壤，按比例加入生防菌剂与土壤充分混匀，并将一定体积的（NH4）2SO4溶液均匀喷洒在土壤表面，使土壤孔隙容积含水量（WFPS）和外源氮含量（按大田150 kg/hm2）分别达到0.5 mg/kg 和75 mg/kg。用封口膜封住瓶口，放置生化培养箱（25±1）℃黑暗培养15 d，并按称重法补充水分[12]。每天09:00 采集气体测定CO2浓度，并在培养时间为1，9，15 d 时采集土样用于有机碳测定和Biolog 分析。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 土壤CO2排放速率测定 将玻璃瓶置于环境空气中30 min，使其充满环境空气，然后盖上带三通阀塑料通气管的橡胶盖子，气密1 h，并分别在三通阀关闭前后采集气体样品30 mL。使用气相色谱仪（Agilent，7890B，USA）测定气体CO2的浓度[13]，参照文献[14]计算CO2释放速率。

1.3.2 土壤有机碳测定 采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法测定土壤有机碳含量[15]。

1.3.3 Biolog-ECO 测定 土壤微生物群落代谢功能多样性采用Biolog-ECO 生态板分析。称取新鲜土样10 g，加入到装有90 mL 灭菌的生理盐水中，200 r/min 振荡30 min，静置20 min 后吸取上清液稀释。取上清液的10-3稀释液150 µL 到生态板孔中，25 ℃培养5 d，每隔24 h 用Biolog 仪测定590 nm 和750 nm 处的吸光值。参照文献[16]计算平均每孔颜色变化率（AWCD）。

选取48 h微平板培养的数据，计算土壤微生物代谢功能的多样性，以及对不同碳源的利用率。采用Shannon 指数（H）、Mclntosh 指数（U）、Simpson 指数（D）、Pielou 指数（J）表示微生物群落代谢多样性的差异[17-18]。具体计算公式如下：

式中，Ci为第i个非对照孔的吸光度，R则为其对应的吸光值；Pi为第i个非对照孔的相对吸光值与所有非对照孔的相对吸光值总和的比值；S为被利用的碳源总数；ni表示第i个孔的相对吸光值。

1.4 数据分析

实验数据采用Excel 2019进行处理分析，用SPSS 26.0进行方差分析和主成分分析，采用Origin 2019进行绘图。

2 结果与分析

2.1 生防菌剂对水稻土壤微生物活性的影响

土壤CO2排放速率随着土壤培养时间的增加，总体趋势逐渐下降，且呈现一定的阶段性特征（图1）。第一阶段为1～2 d，CO2排放速率迅速下降，第二阶段为3～9 d，土壤释放CO2的速率开始出现平缓下降的趋势，第三阶段为11～15 d，此时CO2释放速率下降的幅度更为平缓。在各个阶段中不同处理的土壤CO2排放速率由高到低表现为B4、B2、CK（P＜0.01），说明添加固体菌剂后，土壤微生物群落可能发生了改变，土壤微生物的呼吸和代谢活力增强，使水稻土壤排放的CO2速率增强。而随着培养时间的增加，土壤微生物活性逐渐降低，CO2排放速率趋于平缓，这可能与微生物在有限环境容量中生长会受到抑制有关[19]。

2.2 生防菌剂对水稻土壤有机碳的影响

由表1 可知，添加生防菌剂后水稻土壤有机碳含量显著提高（P＜0.05）。在土壤培养1 d 时，B2、B4组土壤有机碳含量较CK 组分别增加10.2%、17.2%；在9 d 时，B2、B4组土壤有机碳含量相较于CK 组分别增加了19.2%、19.9%；在15 d 时，B2、B4组土壤有机碳含量较CK 组分别增加了19.3%、23.1%。说明菌剂施加于土壤后，可能改变了微生物群落的构成，使土壤中参与有机碳合成的微生物群落活性增强[20]。

表1 水稻土壤有机碳含量Tab.1 Organic carbon content of rice soil

2.3 土壤微生物利用碳源的动力学分析

由图2可知，土壤微生物消耗的碳源量，总体趋势是逐渐增加的，平均每孔颜色变化率（AWCD）值变化规律符合“S”型曲线，但生防菌剂不同施入量和不同采样时间的土壤平均颜色变化率存在较大的差异。在0～48 h 时，不同采样时间点的B2、B4的AWCD 值的增长速率大于CK，48 h 时差异极其显著（P＜0.01）；在72～120 h 时，CK 组的增长速率显著高于B2、B4组（P＜0.05）。对于不同时间点，土壤微生物指数生长阶段的变化存在差异，在48 h 时（图2A），AWCD 值由低到高为CK、B4、B2（P＜0.01），此时1 d 采样点的CK组和B2组的有机碳含量均大于15 d的（表1），说明生防菌剂施入土壤后，外源微生物与土壤原始群落开始了激烈的竞争反应，随着时间的增加土壤微生物的活性逐渐降低，最后进入稳定状态[19]。

图2 不同处理水稻土壤AWCD值和AWCD速率变化Fig.2 Changes of AWCD value and AWCD rate of rice soil under different treatments

根据AWCD 曲线总体的变化趋势，48 h增长速率最大，之后曲线增长趋势开始减缓。土壤微生物在此时Biolog-ECO 生态板的培养时间可以最大限度满足其活性，在一定程度上可更准确地反映不同样品土壤微生物的差异性，所以选取该时间点的数据，进一步分析生防菌剂施入后对各类碳源的利用能力。

2.4 土壤微生物群落代谢多样性分析

根据培养48 h 的AWCD 值计算得到不同取样时间点和处理之间的代谢多样性指数（表2）。B2、B4组的Shannon 指数、Mclntosh 指数和Simpson 指数显著高于CK 组（P＜0.05），而Pielou 指数显著低于CK 组（P＜0.05）。在1 d 时，B2组和B4组的Mclntosh 指数和Pielou 指数差异显著，分别为B2＞B4、B4＞B2（P＜0.05），而在9 d、15 d时各多样性指数差异并不显著（P＞0.05）。CK 组、B2组随着培养时间的增加，Shannon指数、Mclntosh 指数和Simpson 指数均出现显著下降，且CK 组的下降速度显著高于B2组（P＜0.05），而B4组无显著变化（P＞0.05）。

表2 水稻土壤微生物群落代谢多样性指数Tab.2 Diversity index of rice soil microbial community

施加生防菌剂，提高了土壤微生物群落代谢多样性，说明生防菌剂的施加影响了土壤原始微生物的定殖，这可能和土壤微环境稳定性受到改变有关。

2.5 土壤微生物群落利用不同类型碳源的特征分析

Biolog-ECO 生态板上的31 种碳源根据其化学基团的性质，可分为六大类，即糖类（7 种）、氨基酸类（6 种）、酯类（4 种）、胺类（3 种）、醇类（3 种）和酸类（8 种）[18]。选取培养时间为48 h 的数据计算不同土壤微生物群落对这6 类碳源的相对利用率，B2、B4组对6类碳源的相对利用率较为平衡，而CK组对酯类利用率较高，对糖类的利用率极低。随着取样时间点的延长，B2、B4处理组对糖类、醇类和胺类这3类碳源利用率高于CK组；酯类则相反，B2、B4＜CK（P＜0.05）；而对氨基酸类和酸类，随着培养时间的增加CK 与B2、B4无显著差异（P＞0.05）（图3）。

图3 微生物群落对各类碳源相对利用率Fig.3 Relative utilization of various carbon sources by microbial communities

通过不同时间点相同处理之间的比较，可以发现CK、B2和B4组的土壤微生物对醇类的利用相对稳定，而对于酯类和酸类，B2、B4和CK 组之间则存在差异。在酯类的利用上，CK 组随着培养时间的增加，利用率越高；在酸类的利用上，B2、B4组在9 d时达到了最大。

由此可知，水稻土壤原始微生物群落对Biolog-ECO 生态板上的酯类碳源最为敏感，对氨基酸类、酸类其次，对糖类碳源不敏感。施加了生防菌剂后，土壤微生物对糖类、醇类和胺类这3 类碳源利用率提升。可能是入侵群落和原始群落发生了竞争关系，稳定后所形成的土壤微生物群落对碳源类型的利用模式发生了改变[10]。

2.6 土壤微生物碳源利用的主成分分析

选取Biolog-ECO生态板培养48 h的AWCD值，对不同取样时间和不同处理之间，土壤微生物利用单一碳源的特性进行主成分分析。依据PCA 提取原理，提取到多个主成分。其中，第1 主成分（PC1）为68.2%，第2主成分（PC2）为12.4%，2个主成分累计贡献率达到80.6%，其余主成分贡献率相对较小，所以只分析PC1和PC2（图4）。由图4可知，CK 组的不同取样时间点主要分布在第一象限，而B2、B4组主要分布在第四象限，这说明处理组与CK 组相似程度较低，对碳源的利用能力及土壤微生物群落之间存在较明显的差异。而CK 组中取样时间为9 d 和15 d 的两组成分距离较为接近，B4组的不同取样时间点之间又相较于B2组距离较近。这说明随着土壤培养的时间增加，不同组别土壤微生物利用碳源能力的稳定性存在区别，由高到低表现为B4、B2、CK。

图4 不同微生物群落主成分分析Fig.4 Principal component analysis of different microbial communities

进一步将主成分得分系数与31 种碳源进行相关性分析，31 种碳源与PC1 都呈正相关，相关系数大于0.7的碳源有22种，其中，糖类3种，氨基酸类6种，酯类2种，醇类2种，胺类2种，酸类7种。有15种碳源与PC2呈正相关，其中β-甲基-D-葡萄糖苷和D、L-a-甘油磷酸酯这两种碳源与PC2相关系数达到0.7以上，分别属于糖类和醇类。以上碳源对微生物组群区分的贡献率较大，表明土壤微生物群落对这些碳源的代谢存在差异（表3）。

表3 31种碳源与主成分之间的相关系数Tab.3 Correlation coefficients between 31 carbon sources and principal components

3 讨论

3.1 生防菌剂施加对水稻土壤微生物代谢的影响

生物防治菌剂可通过产生抗生素、毒素、表面活性物和胞外降解酶（如蛋白酶、纤维素酶和几丁质酶）达到抑制土壤病原菌生长的目的。在土壤中施用生防菌可能会改变土壤原有微生物群落的结构和功能[17]，刺激微生物的代谢活力，并影响土壤有机碳储量的质量和水平[19]。微生物呼吸是微生物通过分解有机物质并产生一定能量的过程，呼吸作用的强弱在很大程度上反映着微生物的总活性[21]。本研究表明，施加生防菌剂的水稻土壤CO2释放速率显著增高，说明外源菌剂的添加会增强原始微生物群落的代谢活性，这与李青梅等[22]的研究一致。此外，本研究还发现，施加生防菌剂可以显著提高水稻土壤有机碳的含量（P＜0.05）。在土壤培养9 d 时，3 组土壤有机碳含量相较于1 d 均有所下降，而到15 d 时含量均呈现上升趋势，这可能是因为外源微生物的“侵入”使其与土壤原始微生物群落相互竞争生态位，土壤微生物的群落组成和结构改变在一定程度上影响土壤有机碳固定[23]，使得土壤有机碳含量在这段时间内呈下降；而后随着土壤微生物群落趋于稳定，参与有机碳合成的微生物群落活性增强[20]，引起土壤有机碳含量增加；若继续培养有机碳含量可能会逐渐趋于稳定，具体的调节机制还需进一步地研究证明。吴文辉等[24]研究发现，随着还田时间延长，以番茄秸秆（TS）和甘蓝叶残体（CR）为还田废弃物的各处理的土壤有机碳含量略微降低，并趋于稳定。钱壮壮等[20]研究发现，在土壤中添加由芽孢杆菌、放线菌、酵母菌组合的复合菌剂会显著增强土壤的呼吸作用以及提高有机碳的含量，并在培养后期土壤仍会维持较高的呼吸速率。冷雪梅等[7]研究发现，未经处理的水稻土壤呼吸速率和有机碳分解处于一种较稳定的状态。究其原因可能是生防菌的引入给土著微生物群落带来了环境压力，在这种压力下会迫使某些微生物种群组成发生改变或使其休眠，微生物群落将表现出不稳定性[25]，土壤微生物活性和分解有机碳能力受到一定程度的影响。但是土壤CO2释放速率实际上反映的是有机碳矿化的速率，与真实微生物呼吸存在一定偏差，需要结合土壤O2消耗速率一起探究微生物的活性[21]。

3.2 生防菌剂施加对水稻土壤微生物群落的影响

土壤微生物群落是土壤生态环境的重要组成部分[1]，通过调节土壤功能来维持生态系统的稳定性。在水稻土壤中施加生防链霉菌，属于人为添加的外界环境压力，外来微生物与土著微生物之间会进行生态位的争夺，从而影响土壤微生物群落的稳定性[26]。Biolog 方法是基于测定土壤微生物对不同碳源利用能力的差异来表征群落代谢功能的变化[27]，平均每孔颜色变化率（AWCD）反映了土壤微生物利用碳源的能力，其值可以用来表征土壤微生物的活性。AWCD 值越高，则说明土壤微生物利用碳源的能力越强，微生物具有的活性越强[18]。本研究表明，施加生防菌剂的B2、B4组AWCD 值显著高于CK 组（P＜0.05），说明在水稻土壤中施加生防菌剂可以提高微生物的活性。通过分析土壤微生物群落代谢的多样性指数能够较敏感、快捷地表征土壤微生物群落特征的变化[28]，也可用作土壤环境稳定性和土壤质量健康的评价指标，在本研究中，B2、B4组的Mclntosh 指数相较于CK 组达到了极显著水平（P＜0.01），而Shannon 指数和Simpson 指数也显著高于CK 组（P＜0.05），这与余贤美等[17]结果一致。冯发运等[16]研究发现，在施有多菌灵的水稻土壤中接种水稻内生降解菌（寡养单胞菌）可以调高土壤中多菌灵的代谢，同时提高土壤微生物的AWCD 值和群落的多样性指数。白莹等[29]研究发现，在种植木麻黄的土壤中分别施加解淀粉芽孢杆菌（YB706）和伯克氏菌（BK8），两种菌剂都显著提高土壤微生物群落代谢多样性指数。在原始土壤环境中，微生物丰富度、多样性越高，土壤生态系统的抗干扰能力就越强，更具有稳定性[1]。但外源微生物入侵引发的多样性提升与土壤生态系统本身稳定性之间的关系还不明确，不能说明施入生防菌剂可以优化土壤生态系统的稳定性。

3.3 生防菌剂施加对微生物群落碳源利用能力的影响

土壤微生物群落利用碳源的代谢强度和代谢类型的变化在一定程度上能够预测土壤养分变动趋势，是土壤质量健康评价极具潜力的生物指标[27]。本研究表明，水稻土壤原始微生物群落对酯类、氨基酸类和酸类更为敏感，而施加生防菌剂后，微生物群落对糖类和胺类的相对利用率有了显著提升，对各类型碳源的利用变得更加均衡。主成分分析可以用来评估土壤微生物群落对碳源的利用状况，以及区分各处理微生物群落之间的主要差异[16]。从PCA 分析结果可知，施加生防菌剂的B2、B4组微生物群落与CK组差异显著。而随着培养时间的增加，B2、B4处理相较于CK处理土壤微生物群落变动幅度小，更加趋于稳定。其中氨基酸（苯丙氨酸）、胺类（苯乙胺）和酸类（D-氨基葡萄糖酸）这3 种碳源对PC1 作出贡献最大。Angst等[8]通过研究发现，在土壤矿物组分中，植物特有的糖类和酯类占有机碳比例高达10.0%，而含氮化合物氨基酸和部分酸类会选择性结合到矿物表面形成难降解化合物，不易被生物分解和矿化。Cotrufo 等[30]也认为如果土壤中难降解化合物的浓度低，将在一定程度上提高土壤微生物生物量以及土壤微生物对基质的利用效率，最终微生物群落的代谢残留物会与土壤矿物相互作用形成有机质。本研究中，处理组对氨基酸类和酸类这两类碳源的代谢能力增强，说明生防菌剂的引入改变了微生物群落结构和功能，可能在一定程度上降低了难降解化合物的浓度，从而提高了土壤有机碳的含量。但是土壤微生物群落本身很复杂，各物种之间又存在相互作用[25]，而Biolog 方法只能测定部分环境微生物群落的变化（具有一定的选择性），今后还需要结合微生物组学的方法，更深入的探究生防菌剂给水稻土壤微生态带来的变化。

4 结论

施加生防菌剂链霉菌JD211 可以提高土壤有机碳的含量，有助于水稻土壤有机碳的固存。生防链霉菌JD211 的施入提高了土壤微生物群落的Shannon 指数、Mclntosh 指数和Simpson 指数，并改变了微生物群落碳代谢能力，使其对各类型碳源的利用更加均衡，这对于微生物源农药调控微生物群落结构，明确其生态功能具有重要指导意义。