硫氰酸盐高效降解菌群的动力学及微生物多样性研究

汪流伟，肖小双，安雪姣，李宁健，谢 东，张庆华

（江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045）

【研究意义】硫氰酸盐是一种在金矿开采和焦化工业过程产生的含碳、氮、硫等元素的常见化合物，排放浓度高达5 000 mg/L，具有较强的毒性和化学稳定性[1-2]，其主要是通过抑制多种酶的活性，使得多种生物受到迫害[3]，对生活环境造成了极大的危害。鉴于其毒性和来源广泛，工业排放指令规定，硫氰酸盐在焦化废水中的排放浓度必须降低至4 mg/L，为此，硫氰酸盐降解研究就显得尤为重要[4]。【前人研究进展】经研究发现，通过物理、化学和生物方法可有效去除硫氰酸盐[5]，其中物化法效果较差，实施成本较高，有时还会产生二次污染，不能达到排放的标准[6-9]；相比之下，由微生物介导的生物法去除硫氰酸盐具有低成本、高效率、降解完全、不产生二次污染等优点，也是当前国内外研究的主要方法之一。具备降解硫氰酸盐的微生物已从多种来源中分离和鉴定，如Arthrobacter、Klebsiella、Pseudomonas、Ralstonia、Thioba-cillus thioparus、Thioalkalivibrio thiocyanoxidans、Paracoccus thiocyanatus等[10-13]，这些微生物利用硫氰酸盐作为能量和碳、氮、硫源[14-15]，可在不同程度上实现硫氰酸盐的降解。【本研究切入点】与仅借助单一微生物降解硫氰酸盐相比，含有多种微生物的活性污泥的去除具有更稳定、更高的去除率[16]。有研究表明，以硫杆菌为主的微生物群落在连续流动反应器中的最大硫氰酸盐去除率为1.07 mmol/（L·h）[17]；用于自养硫氰酸盐去除的微生物群落也以硫杆菌属物种为主，能够在5 d 内将2 109 mg/L 降解到890 mg/L[18]。这些研究始终检测到硫杆菌属的细菌是降解菌群中的关键菌群，主要参与硫氰酸盐的降解，但是关于复合菌群的降解动力学和生长动力学及降解硫氰酸盐的细菌群落结构了解甚少，对其进行分子生态学研究，为处理实际含硫氰酸盐废水提供新见解。【拟解决的关键问题】本课题组前期从焦化工业废水中富集驯化获得了一组降解速率快、酶活高且结构稳定的硫氰酸盐高效降解复合菌群。该菌群可在27 h内将3 g/L硫氰酸盐完全降解，且可在11 d内将12 g/L硫氰酸盐完全降解，远超现有文献报道的最高水平（7 g/L，12 d）[19]。在此基础上，对复合菌群降解硫氰酸盐速率和菌群生长速率进行动力学分析；采用高通量测序技术，对复合菌群微生物多样性分析及其驯化富集前后的群落结构的演替变化，确定其优势菌群，以期为含高浓度硫氰酸盐废水处理提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 复合菌群来源 本课题组前期从江西省丰城市新高焦化厂的初曝池取样后富集驯化得到的高效降解复合菌群。

1.1.2 培养基 无机盐培养基[20]：NaCl 0.15 g/L，MgSO40.15 g/L，FeSO40.075 g/L，CaCl20.01 g/L，K2HPO41.1 g/L，KH2PO41.1 g/L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 硫氰酸盐检测方法 硫氰酸盐检测采用铁比色法[21]。

1.2.2 生物量检测 将发酵液在4 ℃下8 000 r/min 离心5 min 后收集复合菌群，菌群经蒸馏水3次润洗，离心后再次收集菌群。菌群在室温下干燥后称重。复合菌群生物量计算公式：

1.3 不同初始浓度对复合菌群的影响

将活化的复合菌群按10%（V/V）的接种量接种至分别以硫氰酸盐初始浓度为0.1～15 g/L的无机盐培养基中，在其他条件保持一致的情况下探究复合菌群降解硫氰酸盐及菌群生长的影响。

1.4 硫氰酸盐降解复合菌群的微生物多样性分析

将原始活性污泥与复合菌群菌液离心，将洗涤后的污泥与复合菌群由北京百迈克公司用于细菌总DNA 的提取、PCR 扩增和16S rRNA 测序分析。采用引物27F5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′和1492R5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′进行PCR 扩增。总DNA 提取按照土壤基因组DNA 抽提试剂盒进行。通过数据处理对物种进行注释及分类学分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、组间差异显著性分析、相关性与关联性分析[22]。

1.5 试验设计与数据统计分析

采用origin绘图软件进行绘图，利用SPSS Statistics 25.0进行数据统计分析，每组试验3次重复。

2 结果和讨论

2.1 不同初始硫氰酸盐浓度对复合菌群的影响

硫氰酸盐在一定浓度下对多种酶有抑制作用，因此，硫氰酸盐初始浓度过高时，研究其耐受性是必要的[23]。为了深入探究硫氰酸盐初始浓度对降解率及生长速率的影响，选取浓度范围0.1～15 g/L 的硫氰酸盐进行分析，其结果如图1所示，当硫氰酸盐初始浓度在0.1～1 g/L 时，复合菌群降解速率越来越快；但随着硫氰酸盐初始浓度的提高（2～15 g/L），复合菌群降解速率越来越慢，这可能是复合菌群经历了一段适应期，且硫氰酸盐浓度越高，适应期越长。同样，当硫氰酸盐初始浓度在1～4 g/L 时，复合菌群生长速率越来越快；当浓度进一步提高时（5～15 g/L），复合菌群生长速率越来越慢。在低浓度时（1 g/L），复合菌群降解硫氰酸盐及其生长不受底物限制，当提高浓度（4 g/L），复合菌群的生长速率依旧处于上升的趋势，但降解速率却在降低，结果表明复合菌群生长速率并不完全吻合于复合菌群降解硫氰酸盐速率。

由图1可知，随着硫氰酸盐浓度的逐渐增加，降解所需时间显著延长，硫氰酸盐降解速率和复合菌群生长速率均呈先增后减的趋势。由此说明高浓度硫氰酸盐对该复合菌群的降解及生长具有一定的抑制作用。因此，可以采用底物抑制模型-Haldane方程来描述该复合菌群的降解及生长的动力学方程（方程式如下）。随后利用硫氰酸盐降解时间和降解速率（复合菌群生长速率）进行拟合，结果如表1所示，硫氰酸盐降解速率（菌群生长速率）和降解时间符合线性关系，故该复合菌群对硫氰酸盐的降解动力学和菌群生长动力学符合一级反应动力学。

表1 复合菌群对硫氰酸盐降解及细菌生长的动力学方程及参数Tab.1 Kinetic equation and parameters of thiocyanate degradation and microbial growth of the microbial community

图1 复合菌群对不同浓度硫氰酸盐的降解性能Fig.1 Degradation of thiocyanate at different concentrations by microbial community

式中，V为降解速率[g/（L·h）]，S为硫氰酸盐初始浓度（g/L），Vmax为硫氰酸盐的最大降解率[（g/（L·h）]，Ki为底物抑制常数（g/L），Ks为底物饱和常数（g/L）。Vopt为硫氰酸盐的最佳降解速率/最佳生长速率[g/（L·h）]，Sopt为硫氰酸盐的最佳降解/生长浓度（g/L）。

分别对不同硫氰酸盐浓度下初始阶段降解速率和菌体生长速率的实验值与理论值进行拟合，结果如图3 所示，相关系数R2分别为0.916 51 和0.941 28，说明拟合效果较好。随着硫氰酸盐浓度的不断升高，降解速率和生长速率也依次增大，直到达到最高点即存在最大降解速率Vmax和复合菌群最大生长速率Vmax分别为0.148 79 g/（L·h）和0.236 46 g/（L·h），底物抑制常数Ki分别为32.845 5 g/L 和5.928 0 g/L，底物饱和常数Ks分别为0.051 74 g/L 和1.337 59 g/L，如表2 所示。代入公式计算，得到最佳降解速率Vopt与最佳硫氰酸盐浓度Sopt分别为0.137 85 g/（L·h）、0.121 26 g/L，最佳菌群生长速率Vopt和最佳硫氰酸盐浓度Sopt分别为1.278 28 g/（L·h）、2.784 68 g/L，这些结果与图2的峰值点基本一致。

表2 复合菌群降解硫氰酸盐动力学及细菌群落生长动力学参数Tab.2 Parameters of thiocyanate degradation and microbial community growth kinetics

图2 复合菌群的霍尔丹模型拟合曲线Fig.2 Fitted curves of Haldane model of microbial community

高浓度硫氰酸盐降解速率的降低可能是因为底物浓度高、毒性大，难以被微生物快速利用，其次还可能是高浓度硫氰酸盐阻止了酶的活性区域，降低酶活，从而阻碍了生物降解和复合菌群生长。表明复合菌群在硫氰酸盐降解过程中符合底物抑制模型，进一步明确了硫氰酸盐降解模型的适用性。这与黄会静[24]等研究结果相似，但是其研究的硫氰酸盐底物浓度最大为3 227.21 mg/L，本研究的最高浓度为15 g/L。众所周知硫氰酸盐在实际废水中的含量仅有0.5～3 g/L，但该复合菌群可降解15 g/L的硫氰酸盐，远超报道的最高水平70 mmol[19]，并且能保持较高的降解效率。这为后期利用复合菌群处理高浓度复杂的实际硫氰酸盐废水提供了重要的理论支持。

2.2 硫氰酸盐降解复合菌群微生物多样性分析

2.2.1 硫氰酸盐降解复合菌群群落结构多样变化 为了分析硫氰酸盐降解复合菌群与原始活性污泥的细菌群落结构以及丰富度，在97%相似水平上计算了常见的多样性指数。原始活性污泥和复合菌群细菌多样性指数（表3），覆盖率指数是样品的测序深度也表明样品的覆盖率，6 个样品的覆盖率分别是0.997 4、0.998 5、0.998 2、0.999 2、0.999 2 和0.998 7，表明绝大部分的细菌种群都被检测出来。随着硫氰酸盐降解菌群的富集驯化，降解菌群中的细菌多样指数随之减少，如原始的活性污泥经过培养驯化后，生物分类单元（OTUs）从87、89、84 降为44、44、40，香农指数也从2.667 8、2.857 4、2.714 3 减为1.512 6、1.813 8、1.393 1，这表明细菌多样性及结构在复合菌群中发生了改变，不断提高硫氰酸盐浓度对群落结构产生胁迫压力，使其生物多样性减少。而保存下来的这部分微生物有些可能是硫氰酸盐降解菌，还有些可能与保持污泥稳定性相关，也有可能是它们可以利用硫氰酸盐降解的产物或者次级产物进行生存。

表3 细菌群落多样性指数Tab.3 Diversity indices of bacterial community

2.2.2 硫氰酸盐降解复合菌群群落组成变化 如图3（a）所示，原始污泥的优势菌门主要有Acidobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes。其丰度大约为：57.95%、22.05%、12.49%、1.32%;复合菌群的优势菌门主要有Proteobacteria、Bacteroidetes、Patescibacteria、Armatimonadetes，其丰度大约为：81.04%、14.46%、1.80%、1.34%，这与Wang 等[19]的研究结果相似。其中复合菌群独有的Patescibacteria 已被报道其常与反硝化菌共存[25]，Armatimonadetes 对废水中酚类物质具有较好的降解效果[26-27]。Acidobacteria 在复合菌群中消失的原因可能是在硫氰酸盐胁迫下由于不能有效的利用硫氰酸盐而逐渐被淘汰，有研究表明Acidobacteria 与环境中的C 和N 含量成反比[28]，这也解释了在硫氰酸盐降解过程中氨氮浓度越来越高的原因。Proteobacteria 在原始污泥和复合菌群中都是优势菌门，且在富集驯化过程中丰度明显提高，这说明其在硫氰酸盐的胁迫下不受影响，而且能很好地代谢繁殖[29]。同样Bacteroidetes 也是原始污泥和复合菌群中共有的优势菌门，在后期富集驯化过程中丰度无明显差异，说明Bacteroidetes 能适应硫氰酸盐的胁迫，唐涛涛[30]发现其可降解多环芳烃。

如图3（b）所示，原始污泥中的优势菌属及其丰度为：Uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae、Alicy-cliphilus、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、Diaphorobacter、uncultured _bacterium_f_Mitochondria、Thiobacillus。其丰度大约为：57.95%、12.40%、5.98%、2.80%、2.93%、2.69%;复合菌群中优势菌属和丰度分别为：Thiobacillus、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、Dokdonella、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae。其丰度大约为：77.73%、6.16%、5.63%、2.09%、1.80%。在复合菌群中，原始污泥中的优势菌群Alicycliphilus、uncultured_bacterium_f_Blastocatellaceae和Diaphorobacter均未出现，表明这些菌属不能生存在硫氰酸盐的胁迫下。Thiobacillus已被广泛报道能有效降解硫氰酸盐，且是含硫氰酸盐废水处理系统中的关键菌属，亦可利用H2S 作为能源生长[31-32]，在复合菌群中其丰度大约为77.73%，而在原始活性污泥中其丰度大约为2.69%，结果表明Thiobacillus可能是硫氰酸盐主要的降解菌属。Dokdonella、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae和WPS-2在菌群富集驯化过程中出现，说明这些菌属可以协同利用硫氰酸盐或其降解物生长代谢。uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group丰度在富集驯化过程中没有明显改变，这可能是该菌属可以在高浓度硫氰酸盐胁迫下生长代谢。不同的细菌具有不同污染物降解的功能，同一种细菌也可具有降解多种不同污染物的功能，如Thiobacillus不仅能降解硫氰酸盐，还具有很强的反硝化能力[33-34]。总的结果表明两组样品中不同属在不同样品中的丰度不同，有些菌属的丰度会有变化，说明细菌种群在高浓度硫氰酸盐胁迫下有一定的适应性，群落结构可以通过自身的组成变化适应高浓度硫氰酸盐环境。这也进一步说明该复合菌群的适应性强，这对处理成分复杂的实际硫氰酸盐废水具有极大的优势。

图3 门/属水平上的细菌群落组成Fig.3 Composition of bacterial community at phylum/ genus level

3 结论

（1）研究发现硫氰酸盐降解菌群的降解动力学和生长动力学均符合Haldane模型，最佳降解速率Vopt值和最佳硫氰酸盐浓度Sopt为0.137 85 g/（L·h）、0.121 26 g/L；最佳复合菌群生长速率Vopt值和最佳硫氰酸盐浓度Sopt分别为1.278 28 g/（L·h）、2.784 68 g/L。

（2）复合菌群中发现Thiobacillus、uncultured_bacterium_f_Chitinophagaceae、uncultured_bacterium_f_NS9_marine_group、uncultured_bacterium_f_Saccharimonadaceae、Dokdonella等菌属的丰度较高，其中，Thiobacillus由活性污泥的劣势菌属（丰度大约为2.69%）变为复合菌群的优势菌属（丰度大约为77.73%），被认为是复合菌群降解硫氰酸盐的关键菌属。

本研究结果可为复合菌群在硫氰酸盐废水的实际处置提供研究基础和技术支撑。