β-catenin 在淇河鲫不同组织中的表达研究

吴梦帆，吴利敏＊

（河南师范大学水产学院，河南 新乡 453007）

近几年来，对Wnt/β-catenin信号通路在人类和动物胚胎发育、细胞命运和疾病发病率调节作用的研究和报道越来越多。Wnt/β-catenin信号通路是一条在生物进化中极为保守的通路，广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物[1]。在正常的体细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与E-cadherin形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用。只有当细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合激活胞内的散乱蛋白导致GSK-3β失活，使β-catenin避免被磷酸化而遭降解的命运，β-catenin才能在胞质中积累起来。当胞质中β-catenin的浓度达到一定水平时，就可向细胞核转移。在胞核中β-catenin与转录因子家族LEF/TCF结合，促进下游靶基因表达而导致细胞的增殖、分化、成熟。显然，在这条信号通路中β-catenin发挥了重要作用，其在胞质中积累继而向胞核的转位，被认为是该信号通路被激活的标志[3]。

已有研究表明，Wnt信号通路中β-catenin的过表达或抑制会导致脊椎动物的发育异常。例如：在斑马鱼胚胎中，过表达β-catenin会导致斑马鱼第二体轴的形成[4]，β-catenin的抑制物过表达会降低背部基因的表达，产生腹部化的胚胎[5]；在爪蟾胚胎早期发育过程中抑制β-catenin的表达最终会破坏背部组织的形成[6]。在小鼠中，β-catenin缺失会损害代谢性肝分区和肝脏增殖[7]，而β-catenin过表达会导致代谢分区蛋白不受控制地表达，并导致小鼠肝脏生长不受控制[8]；βcatenin的缺失也会导致小鼠的低骨量表型[9]和眼组织上皮层异常和缺陷[10]。以上结果暗示，β-catenin参与脊椎动物组织胚胎发育和器官发生过程。

淇河鲫（Carassius auratus in Qihe river)属鲤形目（Cypriniformes)鲤科（Cyprinidae)鲤亚科（Cyprinidae)，是天然的三倍体鱼类，具有两性生殖和雌核发育两种繁殖方式。通过异源精子刺激，进行雌核发育，可产生全雌性个体。本研究用免疫组化法检测βcatenin在淇河鲫各组织如眼、脑、鳃、软骨、脾、肝、肠、肾和卵巢细胞中细胞定位。本研究结果将为进一步研究Wnt/β-catenin途径在硬骨鱼发育和器官发生中的作用提供理论和基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取河南师范大学水产养殖基地的淇河鲫作为实验材料。养殖采用带有循环曝气淡水养殖系统的大型养殖池。环境温度保持在24℃左右，光照周期为14 h光照、10 h黑暗。在繁殖季节将雌性淇河鲫与雄性鲤鱼按8:1的比例放入亲鱼池，人工诱导产卵。受精卵在23℃的环境下孵育，直至发育成幼鱼。

1.2 免疫组化分析

采集10 dah幼鱼（全鱼）和120 dah的卵巢组织固定在波恩式液中用于制备组织学切片。室温静置过夜。脱水透明后，石蜡包埋切片，片厚7 μm。石蜡切片脱蜡，复水处理后，用一级抗体和二级抗体孵育，苏木精染色，梯度酒精脱水后，中性树胶封片。显微镜观察组织形态结构是否完整，是否具有阳性信号，并用显微镜采集分析系统镜鉴，拍照保存以待分析。以正常家兔血清为阴性对照。

2 结果

通过免疫组化检测β-catenin在淇河鲫在不同组织细胞中的免疫定位，结果显示β-catenin在肠杯状细胞和肾小管的上皮细胞中呈阳性信号（图1A、B）。如图1C所示，在鳃组织中，鳃小片的泌氯细胞中检测到β-catenin阳性表达。在软骨的软骨基质和软骨膜中也发现β-catenin的阳性信号(图1C）。在肝脏中，βcatenin在肝细胞中表达，在肝血窦中没有发现βcatenin的阳性信号（图1D）。在脾脏中，β-catenin在红髓的巨噬细胞中有表达，而在白髓中无表达（图1E）。β-catenin在眼内表达的区域为全视网膜、色素层和晶状体，而在丛状层未检测到阳性信号（图1F）。

图1 淇河鲫肠（A）、肾（B）、鳃、软骨（C）、肝（D）、脾（E）、和眼（F）组织细胞中β-catenin的免疫定位

在卵巢中，β-catenin在Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞中表达，在Ⅲ期卵母细胞中不表达（图2A）。在脑中，βcatenin在淇河鲫中脑和间脑的支持细胞中表达 （图2C、D、E、F）。

图2 淇河鲫卵巢（A）和脑（C、D、E、F）组织细胞中β-catenin的免疫定位

3 讨论

β-catenin是典型Wnt信号通路中的关键转录调节因子，在动物胚胎发育和器官发生中起着重要作用。为了研究β-catenin在淇河鲫体内各组织中的表达情况，本研究采用免疫组织化学的方法，对淇河鲫各组织中的β-catenin进行免疫定位检测。结果显示β-catenin在淇河鲫多个组织都表达。

在淇河鲫的脑组织，β-catenin在中脑中部和间脑边缘有表达，而在罗非鱼中，β-catenin在中脑边缘和间脑中部表达[11]。在成年小鼠中β-catenin主要分布于皮层、海马、室下层、丘脑及纹状体等区域[12]。这表明β-catenin可能参与脊椎动物神经系统发育，其在不同物种的脑组织中的免疫定位的差异可能是由于不同的发育时期导致的，也不排除β-catenin在不同脊椎动物中可能具体功能存在某些差异这种可能性。报道显示，β-catenin在小鼠骨细胞的间质前体细胞分化为成骨细胞和成骨细胞存活必不可少[13,14]，表明β-catenin参与了小鼠的骨骼发育，在本研究中βcatenin在软骨的软骨基质和软骨膜中的表达暗示其可能在淇河鲫的软骨组织发育中可能有某种作用。已有研究结果表明，在小鼠中，β-catenin在眼部晶状体纤维分化过程中起着独特的作用，参与Wnt信号转导和黏附相关机制，调节晶状体上皮和早期纤维分化[10]。本研究中，β-catenin在淇河鲫眼中也有相似的表达模式，表明β-catenin在淇河鲫眼组织发育过程中可能起着相似的作用。

在120dah淇河鲫的卵巢中，β-catenin在Ⅰ期和Ⅱ期卵母细胞中表达，在Ⅲ期卵母细胞中不表达。βcatenin只在卵巢早期生殖细胞中表达的现象说明βcatenin可能参与早期生殖细胞的增殖和分化等过程。

β-catenin在不同物种各组织中的泛表达表明这种表达模式是脊椎动物的普遍现象，β-catenin在各组织发育中的起着非常重要的作用，其功能可能相似。综上，通过对β-catenin在淇河鲫各组织细胞中的免疫定位研究，可以为以后研究Wnt/β-catenin信号通路在各器官发生中的功能研究提供参考。