生物技术药物氧化检测方法研究进展

李思，罗顺*

（1.江西中医药大学，江西南昌 330004；2.南通市海门长三角药物高等研究院，江苏南通 226133；3.澳斯康生物（南通）股份有限公司，江苏南通 226133）

单克隆抗体（monoclonal antibodies，mAb）因整体稳定性和可制造性，是用于治疗多种疾病（包括癌症、关节炎、免疫性疾病）的最成功的生物技术药物[1-3]。尽管单克隆抗体是一类非常稳定的治疗蛋白，在患者中表现出非常好的药代动力学特征，但它们在生产和储存过程中仍然容易受到各种翻译后修饰的影响。常见的翻译后修饰包括糖基化、N末端谷氨酰胺环化、C 末端赖氨酸丢失、脱酰胺、异构化和氧化[4-5]。

在这些修饰中，通常检测到氧化，并且是由活性氧与暴露于溶剂的氨基酸残基，如甲硫氨酸（methionine，Met）和色氨酸（tryptophan，Trp）反应引起的[4]。氧化过程中涉及的机制很复杂且视具体情况而定：甲硫氨酸容易被过氧化氢通过亲核取代反应氧化生成甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸砜；色氨酸氧化在机理上不同于甲硫氨酸氧化，只容易被自由基和激发态氧物质氧化，通过多种途径降解生成各种氧化产物，包括5-羟基色氨酸、羟基吲哚丙氨酸、犬尿氨酸和N-甲酰犬尿氨酸[6]。氧化可以诱导结构变化，可能会影响单克隆抗体的生物学功效、安全性和免疫原性。尤其是甲硫氨酸和色氨酸侧链氧化，已显示会影响抗体结合片段结晶域（fragment crystallizable，Fc）受体[7-8]和抗原[9]，并影响单克隆抗体稳定性和半衰期[10]。因此，在药物研发和生产的不同阶段监测和表征氧化是至关重要的。

在药物可开发性评估中，计算机模拟日益成为一种常见的预测生物技术药物氧化的方法，其优点是样品消耗少、速度快、成本低。近十年来，计算机模拟已用于预测生物技术药物翻译后修饰易感位点和设计具有更好化学稳定性的抗体。本文就生物技术药物氧化的检测方法、计算机模拟预测氧化进行重点介绍。

1 氧化及其对生物技术药物的影响

1.1 影响氧化的因素

氧化速率取决于肽或蛋白质主链的整体结构和活性的内在因素以及外在因素，例如pH、温度、缓冲液组成、赋形剂（如组氨酸、聚山梨酸）、金属离子、光、过氧化物及溶解氧[11]。单克隆抗体生产过程也会影响氧化，这是由过氧化物、大气氧和氧化还原活性金属离子的存在引起的。

1.2 氧化对生物技术药物的影响

氧化氨基酸在蛋白质序列中的位置对于它们对蛋白质结构、功能和生物学反应的影响至关重要，尤其是对于单克隆抗体而言，结合特性对与目标抗原的顺利结合至关重要。药代动力学特征的变化高度依赖于发生氧化的位置，来自Fc 区的甲硫氨酸的氧化可以减少与新生儿Fc 受体的结合以及相关单克隆抗体的生物半衰期[8,10]。在人类新生儿Fc 受体（neonatal Fc Receptor，FcRn）转基因小鼠中观察到的药代动力学损伤的主要原因是M252 氧化。在这项研究中，当两个免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）重链（Heavy Chains，HC）的M252 被氧化时，观察到血浆清除率增加，互补决定区（Complementarity-Determining Regions，CDR）中的甲硫氨酸或色氨酸的氧化可能会导致效力和抗原结合能力的丧失[12]。

2 生物技术药物氧化的检测方法

2.1 反相-高效液相色谱法

YANG 等[13]开发了一种可靠、准确的反相-高效液相方法来检测单克隆抗体重链上的色氨酸氧化，通过反相方法确定的色氨酸氧化水平与通过体积排阻色谱法观察到的作为预峰的色氨酸氧化量相关。SOKOLOWSKA 等[14]开发了一种高通量、自动化的亚基质量分析方法来监测抗体甲硫氨酸的氧化。在该方法中，用IdeS（IgG 降解酶）、EndoS（IgG 特异性糖苷内切酶）和二硫苏糖醇处理样品，生成三个单独的IgG 亚基（轻链、Fd’和单链Fc）。通过反相超高效液相色谱结合在线四极杆飞行时间质谱仪分析这些亚基，并使用UNIFI 软件解卷积对每个亚基上的氧化水平进行定量。该方法所需样品量少、分析时间短，且UNIFI 软件可以自动采集和处理数据，因此该方法可用于高通量的过程监控和产品表征。

2.2 疏水相互作用-高效液相色谱法

mAb 上氨基酸残基的氧化可通过增加氧化形式的极性或导致构象变化而改变mAb 的疏水性。因此，通常使用基于疏水性的疏水作用液相色谱法（HIC）表征氧化mAb。BOYD 等[15]使用双Dionex ProPac HIC-10 柱实现了最佳分离，并且将氧化的色氨酸分离为预峰，肽图显示氧化的色氨酸位于重链互补决定区中。此外，HIC 方法能够监测互补决定区色氨酸的氧化状态，通过HIC 检测的互补决定区色氨酸的氧化速率与肽图的结果直接相关。相同的方法条件也能够分离氧化的甲硫氨酸产物，这些产物在与氧化的色氨酸不同的保留时间下作为另一个预峰共洗脱，因此HIC 可用于监测IgG1 中互补决定区色氨酸的氧化状态。反相色谱法通常无法对其原始和修饰形式进行定量，不能充分解析带有脱酰胺的天冬酰胺残基和氧化甲硫氨酸残基的肽，而疏水相互作用液相色谱法充分且可预测地将具有这些修饰的肽与其天然对应物分离。然而，疏水相互作用色谱法也存在分辨率差和色谱运行时间长等缺点。

2.3 质谱法

PERDIVARA 等[16]采用液相色谱-串联质谱联用技术对抗体进行表征，并用电泳分离重链和轻链。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）分离和凝胶消化后，发现一些重链和轻链上的色氨酸残基被广泛修饰为双氧化的色氨酸和犬尿氨酸。相比之下，这些残留物在溶液中酶解时没有观察到修饰。这些结果表明，在SDS-PAGE 分离蛋白质时色氨酸氧化可能是一种伪影，因此在使用凝胶电泳分离方法时，应关注这些伪影的存在。

AMANO 等[17]通过质谱首次发现了IgG 分子中组氨酸残基的氧化。位于IgG1 CH2 结构域的特定组氨酸的氧化发生在光照下，但没有在高温下观察到氧化。在质谱分析氘氧化物和重氧化氢中氧化的IgG1的基础上，提出了组氨酸氧化的反应机理。

LI 等[18]开发了一种基于UV 的快速、简单的肽图方法，结合8 min 胰蛋白酶溶液内酶解方案用于分析氧化。能够在1 h 内根据肽的紫外痕迹确定单抗特定残基的氧化水平，无论是叔丁基过氧化氢（t-BHP）处理还是紫外光照的样品。该方法可用于各种稳定性和降解研究中的单抗氧化的常规或高通量分析，并且可以潜在地作为释放测定法实施，已成功用于检测实时稳定性研究中抗体氧化。

WANG 等[19]报告了一种简单、快速的自底向上液相色谱-质谱（uLC-MS）方法，只需5 min 胰蛋白酶酶解就可以同时分析多种修饰，包括氧化、脱酰胺、异构化、糖基化和N 末端焦谷氨酸的形成。与常规的前处理方法相比，uLC-MS 方法消除了酶解时间长而引发的检测伪影。这种简单、低伪影的多属性uLCMS 方法可用于快速、准确地分析抗体药物开发的任何阶段的样品，尤其适用于细胞培养过程中的克隆和培养基筛选。

2.4 氢/氘交换质谱法

为了解互补决定区内特定化学修饰对单克隆抗体属性的影响，使用氢/氘交换质谱（HDX-MS）来研究单克隆抗体互补决定区中甲硫氨酸氧化对构象的影响。结果表明，尽管它们彼此接近，但mAb1 重链中CDR2 中的Asp54 异构化和Met56 氧化对局部和附近区域的构象影响相反，直接导致抗体-抗原结合亲和力发生不同的改变[20]。这项研究揭示了由单克隆抗体CDR 中最常见的两种降解途径引起的局部和整体构象变化的直接证据，并确定了治疗性单克隆抗体的化学修饰、结构和功能之间的相关性。

氢/氘交换质谱可用于评估甲硫氨酸氧化对IgG1 抗体生物学功能的影响。观察到保守的Fc 甲硫氨酸残基的氧化与FcRn 结合和补体依赖性细胞毒性活性的丧失之间存在线性相关性。如HDXMS 和结构模型所示，重链残基Met257 和Met433 均位于FcRn 结合界面附近；然而与HC-Met433 氧化相比，HC-Met257 氧化对FcRn 结合的影响更大，HC-Met257 和HC-Met433 的氧化可以破坏CH2-CH3 界面处的蛋白质构象并防止IgG 寡聚化。HDXMS 证明了两个互补决定区甲硫氨酸残基的氧化对抗体的抗原结合几乎没有影响[21]。这些结果表明，即使翻译后修饰水平相对较低，HDX-MS 也能有效评估单个翻译后修饰对抗体生物学活性的影响，该方法具有高选择性和灵敏度，是辅助评价抗体关键质量属性的有价值的工具。

HAGEMAN 等[22]通过HDX-MS 表征天然和化学氧化的单克隆抗体的构象变化，并通过表面等离子体共振表征抗原-抗体结合。互补决定区内以及附近的色氨酸氧化增加了可变结构域的构象灵活性，并破坏了抗原结合。互补决定区中的色氨酸氧化会对单克隆抗体的构象和抗原结合产生不利影响，因此色氨酸氧化应作为关键质量属性评估的一部分。

2.5 联合应用

HABERGER 等[23]应用特定的反应条件，结合离子交换色谱法、蛋白水解肽图、定量液相色谱质谱法和表面等离子体共振分析的功能评估，以识别和评估重组IgG1 的CDR 中的化学修饰位，LC（轻链）-Met-4、HC-Met-100c 被鉴定为潜在的关键质量属性。但是，如果仅影响抗体的一条轻链或重链，则评估的降解产物不会导致功能完全丧失。

定量超高效液相色谱质谱肽图、经典表面等离子体共振和最近开发的FcRn 柱色谱结合非变性质谱是溶液中天然状态的蛋白质复合物分析的新方法。应用优化的质谱电压和压力条件来稳定气相中的抗体/FcRn 复合物，以便随后使用氧化的IgG1 进行非变性质谱实验。值得注意的是，重链Met-265 氧化对相对结合能力的定量影响仅检测到双氧化IgG1，而仅具有一个氧化重链Met-265 的IgG1 未发现显著影响IgG1与FcRn 的结合[24]。因此，单氧化IgG1 重链Met-265有可能是药代动力学的关键质量属性。

PAVON 等[25]开发了一种新颖的混合模式色谱方法，该方法使用Sepax Zenix SEC-300MK 柱的独特性质来分析单克隆抗体氧化水平。氧化物质的分离基于树脂和抗体之间的体积排阻和疏水相互作用的混合模式。该方法能够将由常见氧化剂t-BHP 诱导的甲硫氨酸氧化物，由2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（AAPH）诱导的色氨酸氧化物或通过UV 光照氧化物的氧化抗体作为预峰进行解析和定量。前峰的特征在于通过LC-MS 确认为质量增加16 Da 或32 Da的氧化抗体变体，该方法已成功应用于IgG1、IgG2和IgG4 亚类的多种单克隆抗体的监测。该方法可用于监测不同位点的总体和单个氧化事件，可用作HIC的补充方法，用于开发和稳定性研究期间监测氧化。

SHI 等[26]报告了阳离子交换色谱（CEX）柱后添加有机溶剂和酸，然后在高温下混合，从而使蛋白质展开，增加离子强度、灵敏度并促进自上而下的分析方法。过氧化氢氧化的mAb 作为模型，产生了额外的CEX 峰。在线CEX-UV-MS 自上而下的分析产生了包含一个或两个甲硫氨酸残基的气相片段，氧化和非氧化碎片离子的丰度可以估算mAb 中不同甲硫氨酸残基的氧化百分比。通过肽图和柱上二硫键还原以及反相液相色谱-自上而下的质谱分析对收集的碱峰进行了证实。总体而言，结果证明了在线方法在提供电荷修饰的特定位点结构信息而无需馏分收集和费力的肽图方面的实用性。

3 计算机模拟预测生物技术药物氧化

虽然现有的检测方法能够鉴定生物技术药物中氧化的氨基酸残基，但这些方法大都用于药物研发阶段，而计算机模拟方法可以根据抗体序列和结构信息来预测药物潜在的氨基酸氧化残基。由于在药物发现阶段就可获得抗体的序列信息，因此计算机模拟方法可在早期用于识别易氧化的氨基酸残基，从而为进一步研究和开发药物提供依据。

预测生物技术药物氧化的计算机方法主要有基于序列、基于结构和基于物理三种，基于序列的方法将可变区中的所有甲硫氨酸和色氨酸残基标记为易受影响的残基[27]。但是由于高级结构会对氧化产生影响，基于序列的方法可能会高估氧化的风险，因为暴露的甲硫氨酸、色氨酸更容易氧化，其他的则不然。溶剂可及表面积（Solvent-Accessible Surface Area，SASA）是一个识别可能氧化的甲硫氨酸和色氨酸残基的预测因子[28]。最近的研究成功地将分子动力学（Molecular Dynamic，MD）模拟和机器学习相结合，以预测甲硫氨酸和色氨酸氧化[29-30]。然而，影响氧化风险的特定因素可能会因潜在残基的类型和氧化的类型而异[31]。

机器学习模型可用来识别潜在的氧化甲硫氨酸残基。YANG 等[32]利用从随机森林模型中得到的甲硫氨酸侧链的SASA，确定了121 个抗体中可能氧化的甲硫氨酸残基。他们观察到侧链溶剂暴露和甲硫氨酸氧化之间有很强的相关性，但存在一定的假阴性。这项研究使用了静态晶体结构的SASA 值，但没有发现因构象变化而引起的甲硫氨酸残基溶剂暴露的改变。SANKAR 等[33]建立了一个随机森林模型，结合SASA 以及硫和芳香族残基之间的距离，预测AAPH对甲硫氨酸的氧化。

最近还有研究探索了在光照下进行甲硫氨酸氧化和AAPH 强制氧化的计算机预测。DELMAR 等[30]除了使用溶剂暴露外，还使用了丙氨酸和甲硫氨酸残基之间的最接近原子距离作为光照下甲硫氨酸氧化的预测因子。相邻的芳族残基能够起到清除游离自由基的作用，从而阻止甲硫氨酸的氧化。H2O2的强制氧化模拟了制剂中聚山梨酸酯中痕量过氧化物的暴露，而光照则是模拟了运输、储存过程中光暴露导致的降解[34]。因此，在不同的强制氧化（如过氧化物和光照）中，应选用不同的甲硫氨酸氧化预测因子[35]。

溶剂暴露是预测色氨酸氧化最重要的因素。SASA 的静态结构不能捕捉到因构象改变引起的色氨酸残基暴露，通过MD 模拟得到的SASA 平均值可以更精确地预测色氨酸的氧化。由于吲哚环的氧化是犬尿氨酸形成过程中的重要环节，因此色氨酸侧链的溶剂暴露可以作为一个重要的预测因子[36]。当色氨酸主链被包裹而侧链暴露时，SASA 能精确地预测氧化。SHARMA 等[29]发现色氨酸的侧链SASA 与AAPH 孵育后的色氨酸氧化有很大的关系。DELMAR等[30]开发了一种随机森林模型，它将二级结构与psi和phi 角相结合，用于预测光照下的色氨酸氧化。在此基础上，未来可以进一步探讨其他结构因子对色氨酸氧化的影响，根据特定应激条件，例如高温、光照、AAPH、过氧化物与痕量金属结合的强制氧化对色氨酸氧化进行计算机预测。

4 结语

氧化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，通常发生于抗体的制备与贮存过程中。由于各位点的氧化程度较低，所以采用强制氧化方法来确定氧化位点。氧化修饰位点会对其生物活性产生一定的影响，使其产生抗体特异性。要保证治疗用药的安全、有效，就必须研究和优化细胞培养、制剂和贮存的相关条件。在生物技术药物研发的早期阶段中，可使用各种计算机模拟工具预测药物潜在的氧化位点，随后模拟在不同生产步骤中遇到的各种条件下进行加速稳定性研究，从而筛选和设计出稳定的药物。未预测到潜在的氧化位点需要花费大量的时间和代价来补救，而错误的预测易氧化的位点则会导致药物的过度设计，因此在使用计算机模拟预测氧化时应根据具体的研究情况选择合适的预测方法。目前国内对生物技术药物中氧化的检测项目很少，而且对其氧化产物的含量限值也没有规定，有关的定性和定量分析方法更是一片空白。建立高效、准确测定生物技术药物中氧化产物的方法，尤其是含量测定方法，将其与国际接轨，对生物技术药品的生产和市场流通进行有效的监督，可以更好地保护人们的生命，规范药品的使用。随着氧化检测技术的发展，如何使其更好地用于临床检验，建立高效、准确的质量标准是一个值得思考的问题。