细菌性肺炎患者呼出气与细菌培养顶空气体光声光谱的对比分析

刘静莎，张健鹏

（1.北京市顺义区医院重症医学科，北京 101300 ；2.中国人民解放军总医院第三医学中心呼吸科，北京 100039）

自1971 年Pauling 等[1]发现人呼出气体中存在着极微量的挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）以来，相关的基础研究显示，呼出气VOCs 可能对一些疾病的早期诊断具有价值。人体内的VOCs 是在人体组织的正常生理过程及与疾病相关的病理过程中产生的[2]，是体内代谢过程的降解产物，可以通过呼出气获得，其成分直接因病理过程（如感染或恶性肿瘤）而发生改变[3]。VOCs 谱的变化可能反映了整个身体或特定组织的代谢紊乱[4]。近年来，VOCs 已经显示出作为各种疾病生物标志物的巨大潜力[5]，VOCs 的使用已被提议作为一种快速、潜在低成本和非侵入性的方法来诊断多种疾病。本研究拟采用光声光谱技术（Photoacoustic spectroscopy，PAS）进行检测，观察比较细菌性肺炎患者的呼出气与同种细菌顶空气体VOCs 光声光谱图之间的差异，以评价细菌性肺炎患者的呼出气对同种致病细菌是否具有代表性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

肺炎组：随机选择2021 年1 月至2022 年1 月期间在某三甲医院住院的痰细菌培养阳性的肺炎患者20例，其中大肠杆菌感染性肺炎4 例，肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎8 例，铜绿假单胞菌感染性肺炎8 例。纳入标准：（1）年龄18 ～80 岁，性别不限；（2）确诊细菌性肺炎；（3）连续三次痰细菌培养发现同一种致病菌；（4）无吸烟史，无循环系统疾病、消化系统疾病、糖尿病、肾功能不全等；（5）对研究知情同意。排除标准：（1）合并其他系统疾病；（2）需要进行有创或无创通气；（3）存在通气或换气功能障碍；（4）无法配合正确收集呼出气体。细菌组：选取大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌三种细菌为研究对象，这三种细菌均通过对上述患者进行痰细菌培养分离得到，对致病菌进行传代接种，得到单纯致病菌株。

1.2 实验器材

1.2.1 光声光谱分析仪（型号：PASTA- 10001）由中国航天科技集团某研究所提供，仪器主要参数：采样容积：30 mL；检测时间：30 min；检测精密度：PPb 级；工作适宜温度：0℃～40 ℃。该仪器测量结果的稳定性较好，不会因为环境温度和气压的变化而产生漂移。

1.2.2 培养仪器 Tedlar 气体采样袋（图1）及外接一次性吹嘴，购于大连德霖气体包装有限公司。Tedlar气体采样袋容量为300 mL，反复利用时需用纯氧气进行反复充气和抽气，并在60 ℃条件下老化4 h（经过老化后的采样袋能有效降低背景值，可以再次使用）。增菌培养基（哥伦比亚型）购于赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司。双通道玻璃气密样品取样瓶为实验小组自行设计制作（图2）。恒温恒湿培养箱由北京中西远大科技有限公司提供，产品参数：型号：TH70-HWS-350；控温范围：5℃～50 ℃；温度波动度：±0.5 ℃。

图1 Tedlar 气体采样袋

图2 双通道玻璃气密样品取样瓶

1.3 方法

1.3.1 气体收集 （1）肺炎组呼出气收集：①Tedlar采样袋第一次使用时用蒸馏水清洗，烘干，去除残留物，以后重复使用时用纯氧气进行反复充气和抽气3次，以置换残留气体，备用。②受试者晨起空腹安静状态，在通风良好的室内平静呼吸0.5 h，用清水进行口腔清洁后待测。③连接一次性吹嘴，打开夹子，嘱患者向Tedlar 采样袋中吹气，反复呼吸数次，尽量使袋内气体接近肺泡气体浓度。④关闭夹子，10 min内连接光声光谱仪进行检测。（2）细菌顶空气体收集：将三种目标细菌接种到增菌培养基（哥伦比亚型）平板中，将培养基放至双通道玻璃气密样品取样瓶中，放于35 ℃恒温恒湿培养箱中培养24 h 得到细菌顶空气体。

1.3.2 气体光声光谱检测 肺炎组：将收集好呼出气且处于夹闭状态的Tedlar 气体采样袋的出口端用橡胶管与PASTA1001 进气阀管连接，然后运行机器抽气1 min，形成管道负压（此时池压为233 mBar）。打开橡胶管抽气，当仪器显示压力平衡后运行机器，开始检测，分别获得初始实验数据和初始光谱曲线（横坐标X 值表示波数，单位为cm-1，纵坐标Y 值表示幅值，单位为au），本研究选择检测波数范围为1000 ～1250 cm-1，因为此波数段可涵盖绝大部分的VOCs 和部分无机挥发性化合物，且幅值与所测挥发性化合物的浓度成正比。细菌组：将取样瓶上端的橡胶管（止血钳夹闭状态）与光声光谱分析仪的进气阀连接，打开进气口橡胶管上的止血钳，对取样瓶中的顶空气体进行抽气检测，获得初始实验数据。重复上述方法检测其他取样瓶中的气体实验数据。

1.4 数据分析

本实验采用Originpro 8.5 绘图软件对初始实验数据进行分析，合成光声光谱图（X 值表示波数cm-1，Y 值表示幅值au），选择检测的波数范围为1000 ～1250 cm-1，因为此波数段可涵盖绝大部分的VOCs 和部分无机挥发性化合物，其中幅值与所测挥发性化合物的浓度成正比。

2 结果

2.1 大肠杆菌培养顶空气体（细菌培养大肠）与大肠杆菌感染性肺炎（大肠）患者呼出气的光声光谱检测结果

如图3 所示，在增菌培养基培养24 h 的大肠杆菌顶空气体的光声光谱检测结果显示：1236 ～1238波 数 段、1228 ～1232 波 数 段、1120 ～1126 波 数段：大肠杆菌顶空气体均出现了与大肠杆菌感染性肺炎患者相似的波峰。同时发现，大肠杆菌培养顶空气体的光声光谱结果在1120 ～1126 波数段的波峰与大肠杆菌感染性肺炎患者呼出气产生的波峰形态不完全相同，似乎右侧又有一个小峰，使该峰变成双峰，但可能因浓度较低，不能完全形成波峰。另外，大肠杆菌细菌培养顶空气体的光声光谱检测结果在1120 ～1126 波数段呈现的波峰形态相同，但患者呼出气检测结果却呈现出多样化改变。

图3 大肠杆菌感染性肺炎患者呼出气与相应细菌培养顶空气体检测结果的比较

2.2 肺炎克雷伯杆菌顶空气体与肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者呼出气的光声光谱检测结果

如图4 所示，在增菌培养基培养24 h 的肺炎克雷伯杆菌顶空气体的光声光谱检测结果中发现：（1）1240 ～1242 波数段：出现与肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者呼出气中相似的波峰，但波峰不明显，幅度存在差异；（2）1236 ～1238 波数段：并未出现与肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者呼出气相应的波峰。另外，我们发现肺炎克雷伯杆菌细菌培养所得到的顶空气体光声光谱检测结果中在1240 ～1242 波数段产生的波峰均较平坦，而肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者的呼出气在此波数段产生的波峰较尖锐，相似但不完全相同。

图4 肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者呼出气与相应细菌培养顶空气体检测结果的比较

2.3 铜绿假单胞菌顶空气体与铜绿假单胞菌感染性肺炎患者呼出气的光声光谱检测结果

如图5 所示，在增菌培养基培养24 h 的铜绿假单胞菌顶空气体的光声光谱检测谱线中发现：（1）1214 ～1216 波数段：并未出现与铜绿假单胞菌感染性肺炎患者相似的波峰，曲线较平坦；（2）1228 ～1232 波数段：出现了与铜绿假单胞菌感染性肺炎患者相似的波峰。

图5 铜绿假单胞菌感染性肺炎患者呼出气与相应细菌培养顶空气体检测结果的比较

3 讨论

临床实践中对于下呼吸道感染的患者，尤其是急危重症患者，及早明确感染的病原菌极其重要，可影响患者的救治时机，甚至会直接影响患者的预后和病死率。另外，随着临床抗菌药物的广泛应用，感染性疾病患者中耐药菌株的种类和数量逐年增加。因此，准确检测病原微生物有助于临床制定精准的治疗方案，防止抗生素的滥用，同时也减低了患者的平均住院时间和平均住院费用，减轻了患者家庭的负担。目前，临床上常用的检测病原菌的方法有微生物分离培养、抗原检测、血清学抗体检测、常规病原学核酸检测等。其中微生物分离培养被认为是病原学检测的金标准，但培养时间长，周期通常在2 ～14 d 左右，最长可达21 d，易影响患者的及时救治。另外，微生物分离培养的条件要求高、易失败、混杂因素多，且敏感性较低，并不利于疾病的早期诊断。抗原检测是通过检测病原体表面的糖蛋白抗原物质来判断机体感染何种病原体，可用于早期的快速病原诊断。但抗原检测易受到采样限制，病原体浓度低时，敏感度相对较差，且检测阴性并不能排除感染。抗体检测因免疫窗口期较长，不能用于急性感染的病原学诊断。常规病原学核酸检测的敏感度和特异性高，不受抗菌药物应用的影响，无免疫窗口期，但因气溶胶污染可能造成假阳性，部分病毒阳性不能确定现症感染的问题。因此，针对下呼吸道感染，探索一种无创、准确率高、及时快速、敏感度高、符合临床实际的快速病原学检测方法非常必要。近年来，VOCs 检测技术的蓬勃发展，无疑为解决这个问题指明了新的方向。

在医疗领域，人体呼出气中的多种气体都可以作为医疗诊断的生物标志物[6]。如呼出气一氧化氮检测被临床呼吸科广泛应用于检测气道炎症的性质和程度，协助支气管哮喘的诊治，评估肺癌患者的气道炎症等，已然是一种极为成熟的检测技术。目前，检测VOCs 的方法主要有气相色谱法、质谱法、光谱吸收检测法、传感器或电子鼻法以及PAS 等[7]。气相色谱法的设备复杂、体积较大且价格昂贵，很难用于现场测量。质谱法对于不能气化时发生分解的化合物不适用。光谱吸收检测方法是基于气体对特定波长光的吸收，通过吸收光谱和光强度的变化来判断气体的浓度，易受到光散射的影响。电子鼻是一种能够模拟动物嗅觉的电子装置，由三大功能部件组成，分别是气体采样器、气体传感器阵列和模式识别系统。其工作原理是进入电子鼻的气体样品与传感器发生可逆的物理、化学反应，产生电信号，电信号通过放大、数字转换进入信号处理系统和模式识别系统，完成对气体样品的检测。目前，关于上述检测方法的研究均存在着样本量小、检测方法复杂、可重复性差、检测标准和方法不统一、对操作人员要求高等不足，因此，离实际临床应用尚有较大距离。PAS 是通过测量光声效应产生的声波信号，而不是采用直接测量光强度的变化来达到对气体检测的目的，其检测结果与光的散射和透射无关。因此，PAS 是一种无背景信号干扰的间接测量方法，具有灵敏度和选择性高、容易实现多气体检测的优点，使得该技术在多组分气体检测方面具有十分广阔的应用前景。

气相色谱法的检测模式是必须事先明确目标气体成分，之后再检测该气体是否存在，所以采用的是“逆推”模式。传感器和电子鼻法则是先通过气味传感器对目标气体进行初步识别，之后再对整体气体混合物的生物挥发性特征进行检测判断，而后以某种相似的属性进行重新组合排列，进而区别气体成分，也就是说采用的是“顺比较法”模式。本研究所采用的PAS既可以通过“顺比较法”，根据不同细菌挥发性有机化合物所形成的光声光谱图之间的差异来辨别病原菌，又可以通过“逆推”模式，进一步验证目标气体是否存在[8]。因此，可大大提升灵敏度，且该方法操作简单、快速、无创且成本低，1 h 左右即可做出准确的诊断，无疑给医生的临床决策提供了快速、精准的技术支持。这也是该方法在病原学检测中的优势所在。用PAS 检测VOCs 为病原菌的鉴定提供了一种简单、快速的方法，有望成为临床早期病原学检测的新技术。

本研究通过对细菌性肺炎及同种致病菌培养顶空气体进行光声光谱分析发现，大肠杆菌顶空气体在1120 ～1126 波数段均出现了与大肠杆菌感染性肺炎患者相似的单峰；肺炎克雷伯杆菌顶空气体在1240 ～1242 波数段出现了与肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者呼出气中相似的波峰；铜绿假单胞菌顶空气体在1228 ～1232 波数段也出现了与铜绿假单胞菌感染性肺炎患者相似的波峰。同时还发现，大肠杆菌培养气体的光声光谱结果在1120 ～1126 波数段的波峰与大肠杆菌感染性肺炎患者呼出气产生的波峰形态又不完全相同，似乎右侧又有一个小峰，使该峰变成双峰，但可能因为浓度较低，不能完全形成波峰。同样的，肺炎克雷伯杆菌细菌培养所得的顶空气体光声光谱检测结果中在1240 ～1242 波数段产生的波峰均较平坦，而肺炎克雷伯杆菌感染性肺炎患者在此波数段产生的波峰较尖锐，二者相似但不完全相同。同一种细菌培养所得的顶空气体的光声光谱检测结果在同一位置出现的波峰相同，但人体感染后的呼出气在相同位置的波峰却出现了多样化，如大肠杆菌感染性肺炎患者的呼出气在1120 ～1126 波数段有单峰、有双峰，体现了人体呼出气混杂因素的多样性。这充分印证了人体呼出气中的VOCs 其成分直接因病理过程（如感染或恶性肿瘤）而发生改变[3]。可见，人体是一个复杂多变的整体，加之呼出气的混杂因素较多，在细菌与机体的相互作用中，细菌单独培养及人体感染后所产生的代谢产物是否有所变化及具体机制如何，有待于进一步研究明确。此外，由于本研究中的样本量很小，数据对整体的代表性欠佳，且细菌培养过程中可能出现其他细菌的污染、细菌在不同代谢时间产生的代谢产物不尽相同等多种混杂因素的存在，均可影响实验数据。因此，未来我们将进一步扩大样本量，完善实验方法及检测技术，使下一步的实验更加完善，实验结果更加可靠。