他仑帕奈对脑缺血再灌注大鼠脑组织内Caspase-3表达及血清炎性因子的影响

石秋艳 李冠一 杨斌 王翠兰 李弘 闫玉敏 何静远

华北理工大学附属医院神经内科 河北唐山 063000

脑梗死目前已成为我国居民(尤其是农村人群)死亡的首要病因,其发病率、致残率、死亡率和复发率高,且发病呈年轻化趋势[1-2]。在一定时间脑梗死恢复血液供应后,其功能不仅未能恢复,还出现了更加严重的脑功能障碍,称为脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion,CIR)。CIR发生机制较为复杂,主要与兴奋性氨基酸的过度释放、细胞内钙超载、氧自由基产生和血脑屏障的功能障碍有关[3]。当脑梗死发生时,谷氨酸等大量的兴奋性神经递质增加,从而导致钙快速涌入和兴奋毒性诱导神经细胞调亡[4]。他仑帕奈(Talampanel,TAL)是一种新型非竞争性AMPA受体拮抗剂,易透过血脑屏障,可通过减少Ca2+的过度内流,降低谷氨酸的兴奋毒性,改善神经功能,减少组织损伤和细胞死亡。TAL仍处于三期临床试验阶段,可用于抗癫痫治疗,但其对脑缺血再灌注后的神经保护作用,国内相关研究仍较少。

本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型,在不同时间段应用他仑帕奈,观察其对大鼠缺血侧半球梗死体积、梗死灶周围半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达以及血清炎性因子血清肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素-1β(IL-1β)浓度的影响,探讨其在脑缺血再灌注后的神经保护作用,为缺血性脑血管病的神经保护治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级SD大鼠90只,雄性,单只体质量180g,由北京华阜康生物科技股份有限公司出售,中国医学科学院医学实验动物研究所进行质量检测,华北理工大学动物实验中心统一购置,动物证号:SCXK(京)2020-0004,在安静环境条件下给予标准饮食及自由饮水进行1～2周适应性饲养。术前12h禁食,2h禁水。本研究经医院动物实验伦理委员会批准实施。

1.2主要实验试剂 兔抗Caspase-3抗体;水合氯醛(上海恒远大生物科技有限公司);TTC染液、过氧化氢(上海信裕生物科技有限公司);TAL(爱必信上海生物科技有限公司);免疫组化试剂盒(白介素-1β、TNF-a,北京生东科技有限公司)。

1.3主要实验仪器 尼龙线栓、动物线栓切片机(瑞沃德生命科技有限公司);KD2508石蜡轮转切片机(北京世纪科信科学仪器有限公司);SM-150D超声波细胞破碎仪(南京舜码医疗仪器设备有限公司);大鼠脑立体定位仪(上海玉研仪器设备有限公司);电热恒温隔水式培养箱(上海培因仪器有限公司);烤片机(浙江金华市科迪仪器设备有限公司)。

1.4实验方法

1.4.1实验动物分组 利用抽签法随机将90只SD大鼠分为假手术组(Sham组),MCAO模型组,TAL治疗0h、1h、3h、5h组,每组均为15只。

1.4.2造模方法 术前对SD大鼠禁水2h,并停止喂养饲料12h,实验大鼠术前腹腔内注入水合氯醛(3.5 mg/kg)。麻醉成功后采用改良 Longa线栓法[5]制作大鼠CIR模型,采用尼龙线栓阻塞大鼠右侧大脑中动脉,制备大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。缺血2h后拔线实现再灌注。Sham组只进行麻醉和血管分离术,不结扎血管及导入线栓,其余手术过程相同。术后大鼠保温,维持大鼠核心体温在 36℃～ 37℃。

1.4.3给药时间及剂量 大鼠 MCAO模型制备成功后,TAL治疗组经尾静脉在复灌后不同时间点注射TAL(12mg/kg),Sham组和模型组给予等量生理盐水处理。

1.4.4脑梗死体积的测定 给药24h后,将各组大鼠全部麻醉至死,然后迅速取出大脑,并切除嗅球、小脑和下脑干。提取脑组织在 -20℃下冷冻20min。从额极开始,脑组织按照从前到后的顺序以1mm间隔的冠状位切片。将脑片浸泡在2% TTC 溶液中,37℃孵育30min。最后将脑组织切片固定于10% 甲醛溶液中过夜,温度维持在4℃,脑片白色部分为梗死区,红色部分为非梗死区。用Image-Pro Plus 6.0软件对每个脑切片的白色区域进行3次检查,得出平均值。干湿比重法测定脑梗死体积。

1.4.5石蜡切片的制备 脑组织切片厚度约为4mm,同一部位的每个标本保存4片,然后将切片置于温水中,温度约为40℃,将蜡完全压平,最后固定在载片上。玻片在60℃的恒温箱中干燥,用水冲洗3次,苏木精染色10min。用水冲洗3次后,切取载玻片,先用1% HCL分化,然后浸泡在1% 曙红溶液中,最后用乙醇脱水,二甲苯透明2次,用中性树脂封闭载玻片,光镜下观察海马 CA1区神经元。

1.4.6免疫组化检测梗死周围区Caspase-3的表达及存活神经元数量测定 制备的大鼠石蜡切片脱蜡后,在3% H2O2培养箱(37℃)中培养10min。在高温高压条件下暴露抗原30min,冷却至室温,切片干燥,用山羊血清覆盖非特异性抗原,在37℃下孵育20min。然后加入单克隆兔抗 NeuN抗体(1:400)和兔抗 Caspase-3抗体(1:200) ,使抗原与抗体充分反应。抗原和抗体在4℃温度下隔夜固定,在培养箱中孵育30min,然后用 PBS溶液冲洗3次,切片干燥后滴入二抗在培养箱继续孵育。用PBS溶液冲洗剩下的抗体。玻片干燥后,加入显色剂,室温培养10min,然后用PBS溶液冲洗多余的污渍。高倍显微镜下观察半暗带缺血区 Caspase-3的表达及存活神经元数量。

1.4.7免疫组化试剂盒检测血清 TNF-α 和 IL-1β水平 给药24h后,各组大鼠麻醉至死,迅速取出大脑,切除嗅球、小脑和下脑干。取手术侧脑组织,称重后用4℃生理盐水制成10%脑组织匀浆。匀浆液经 3500 r/min 离心15min,r=8cm,取上清液移入 EP 管,-20℃的冰箱中保存,严格按照试剂盒说明书测定脑组织 TNF-α和 IL-1β的表达水平。

1.4.8神经功能损伤评分(Longa评分) 根据Longa评分标准进行评分。0分:无神经功能缺陷;1分:瘫痪侧前爪不能完全伸展;2分:行走时向瘫痪侧转圈;3分:行走时向瘫痪侧倾倒;4分:不能自动行走,存在意识丧失现象。

2 结果

2.1各组大鼠脑梗死体积、Longa评分及存活神经元比较 实验结果显示,Sham组大鼠神经功能正常,Longa评分0分,未见脑梗死灶。TAL各治疗亚组及MCAO组出现不同程度的神经功能缺失,在大脑中动脉供血区出现大小不等的梗死灶,主要位于额叶、顶叶和颞叶。与MCAO组相比,TAL各治疗亚组中NeuN阳性细胞数量较多,梗死体积减小,神经功能评分改善(P<0.05),其中,相比于5h组,0h组、1h组、3h组梗死灶体积明显减小(P<0.05)。见表1、图1～3。

图1 各实验组鼠脑梗死体积的比较

图2 各实验组鼠Longa评分比较

图3 各实验组鼠NeuN阳性细胞数比较

表1 各组大鼠脑梗死体积、Longa 评分、NeuN 阳性细胞比较

2.2各组实验大鼠海马CA1区神经元细胞形态学改变比较 Sham组海马CA1区神经元细胞排列整齐,形态完整,大部分细胞胞质丰富,核仁清晰,染色质分布均匀;而MCAO组及TAL各治疗亚组大鼠海马CA1区神经元细胞均出现不同程度的神经元细胞紊乱、胞核固缩、碎裂甚至神经细胞坏死。与MCAO组相比,TAL -0h组神经元细胞排列较松散,有少量小胶质细胞浸润,少量核固缩现象;TAL-1h组神经元细胞出现较多核固缩现象;TAL-3h组神经元细胞损失多,核固缩现象明显,组织间存在轻度水肿变性;TAL-5h组神经元细胞核固缩现象多见,小胶质细胞浸润显著,组织间水肿变形明显。见图4。

图4 各组大鼠海马CA1区神经元细胞形态比较(HE 400×)

2.3各组实验大鼠梗死周围区Caspase-3及血清炎性因子水平情况比较 在Sham组中的大鼠缺血半暗带只有极少量Caspase-3阳性细胞,血清炎性因子水平较低;但在MCAO组及各TAL治疗亚组中,可以见到缺血半暗带Caspase-3阳性细胞数量及血清炎性因子水平明显高于正常,与Sham组大鼠比较,差异均具有统计学意义(P<0.05);另TAL0-3h组相比于MCAO组及TAL-5h组,可见缺血半暗带Caspase-3阳性细胞表达明显减少,血清炎性因子明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);此结果提示TAL能够减少中枢神经系统病灶周围及其伴随的全身炎性反应,在给药时间3h内效果明显。见表2、图5～8。

图5 各实验组鼠caspase-3阳性细胞数比较

图6 各实验组鼠TNF-a表达水平的比较

图7 各实验组鼠IL-1β表达水平的比较

图8 各组大鼠梗死周围区 Caspase-3阳性细胞表达比较(免疫组化 400×)

表2 各组大鼠脑梗死梗死周围区Caspase-3及血清炎性因子水平比较

3 讨论

谷氨酸(glumate,Glu)是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质,能够介导大脑皮层和海马等部位的兴奋性神经传导[6],当其水平病理性升高时,亦可作为一种神经毒素诱导严重的神经元损害[4]。Glu对神经细胞的过度兴奋或过度刺激都将导致神经细胞凋亡,在外源性和内源性配体的激活下,Glu受体招募其适配蛋白,激活下游的激酶,从而诱导促凋亡基因的表达[7],这种病理过程被称为Glu的神经毒性[4],而此病理过程几乎出现在所有神经系统疾病中[8-9]。Glu受体包括NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸受体)和非NMDA受体,后者又包括AMPA受体(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体)和海人草氨酸受体[10]。在缺血性脑卒中中,细胞外Glu在缺血后迅速升高,再灌注后下降,而AMPA受体参与Glu介导的兴奋性损伤,其造成的Ca2+通透性增强能介导神经元的死亡。同时,AMPA受体有活性是NMDA受体兴奋的前提,阻断Glu受体能够显著降低或者抑制兴奋性突触活动,减少钙稳态失衡造成的神经元损伤[11],这也是AMPA受体拮抗剂可减少神经元损伤的可能机制之一。

TAL是一种苯二氮卓类的衍生物,是AMPA受体的变构调节剂,这意味着与竞争性拮抗剂相比,此药可能更具有优势,尤其在Glu突触强烈活动的癫痫发作[12],或者在与大量细胞外Glu释放相关的缺血事件及其他脑损伤期间[13]。有研究发现,TAL对颈动脉缺血大鼠有脑保护作用[14]。相对于阻断NMDA受体,阻断AMPA受体效果更为显著,同样AMPA受体在神经元过度放电的过程中起到重要的作用。本研究的目的则是评价非竞争性AMPAR拮抗剂TAL在大鼠MCAO模型中的神经保护作用。本实验研究的结果提示,非竞争性AMPA受体拮抗剂TAL在大鼠脑缺血再灌注后能显著减轻中枢神经系统损伤,减少神经元凋亡,尤其提示用药越早,神经保护作用越显著,在缺血再灌注后5h内给药效果良好,超过5h给药效果不佳。

目前已知Caspase-3在再灌注损伤后的细胞凋亡中起着十分重要的作用[13],是细胞凋亡的中心环节与执行者。已有证据表明,抑制Caspase-3的活化可以减轻脑缺血后的细胞损伤,增加神经元的存活数量,并有效改善神经功能[14]。因此Caspase-3在细胞凋亡中起着不可忽视的作用,其在局部的表达程度,代表了局部炎症反应的剧烈程度。在包括缺血性卒中的神经系统疾病中,炎性细胞因子的产生和释放改变亦参与了中枢神经系统限制性炎症反应。IL-1β和TNF-a是两种有效的炎性细胞因子,在许多动物模型中被证明能够调节实验性中风的缺血性损害的大小[15]。这些细胞因子可以直接作用于缺血神经元,从而促进脑梗死的进展[16]。TNF-α 和IL-1β缺乏的小鼠脑梗死体积缩小的研究结果也支持炎性细胞因子水平影响中风梗死的证据[17]。IL-1β对CIR的机制可能是激活内皮细胞,导致血栓形成,或诱导细胞间粘附分子表达增加,从而使大量中性粒细胞浸润到脑组织中,诱发炎性发应[18];TNF-α可以引起多核白细胞聚集和激活并释放炎性介质,是脑梗死形成的主要原因[19]。在整个机体的一系列炎症反应中,TNF-a、IL-1β作为T细胞介导的炎性因子,参与免疫应答过程,其在血清中的含量代表了不同时间和不同个体的炎症反应程度,间接反应了脑损伤的程度。本研究证实了Caspase-3以及这些炎性细胞因子在MCAO模型中的表达增加,这与已有研究一致[20-21],而TAL各治疗组脑组织梗死体积缩小、血清Caspase-3表达以及TNF-a、IL-1β水平降低。

Glu诱导的兴奋性毒性在谷氨酸受体过度刺激时迅速发展[22]。因此,Glu拮抗剂可能只在缺血开始后和再灌注后的短时间内作为神经保护剂有效,这一理论与我们目前的结果相符。治疗3h内,TAL在局灶性MCAO模型中产生了显著的神经保护作用,而延迟至缺血后5h,其神经保护作用并不显著。目前用于急性缺血性卒中的治疗包括静脉溶栓以及血管内机械取栓治疗,可在脑卒中早期实现闭塞血管的再通,时间越早效果越显著。这说明TAL与静脉溶栓药物rt-PA合用可能延长药物治疗的治疗窗,对早期拯救缺血半暗带区、减少神经元细胞的损伤有协同作用,且干预越早给患者带来的益处越大。

综上所述,TAL能够减少Caspase-3的表达及血清炎性因子TNF-a、IL-1β水平,减少神经元凋亡及全身炎症反应,增加脑缺血半暗带区神经细胞的存活数量,对血管再通后的再灌注脑损伤有很好的保护作用;且其作用效果与用药时间有关,脑灌注损伤后早期用药效果更优。这种作用机制可能是通过抑制急性缺血、缺氧脑组织中高浓度的Glu对AMPA受体的过度激活、抑制神经元的过度兴奋、减轻局部及全身炎症反应,进而达到保护神经的作用。