低氧诱导因子-1α对胶原诱导关节炎小鼠脾细胞中T细胞亚群的调控作用*

孟 金, 康 敏, 芦彦蓉, 郭 煜, 庞春艳

[1.包头医学院第一附属医院中心实验室(内蒙古自治区自体免疫学重点实验室),内蒙古 包头 014010;2.包头医学院]

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的特征是慢性滑膜炎症以及软骨和骨的进行性破坏,它具有很高的致残率。RA 的发病机制尚未完全阐明。许多因素会影响 RA 的发病,包括环境因素[1]、遗传[2]和微生物群[3]的相互作用,各种免疫细胞的激活及其相互作用[4-6]等,最终会使免疫耐受性异常,导致针对滑膜的自身免疫性疾病的发生和发展。

研究发现,T 细胞的异常活化和增殖是 RA 炎症、免疫活化和骨破坏的重要因素。大量的 CD4+T 细胞浸润滑膜组织,在抗原和细胞因子的作用下被激活并分化成具有免疫作用的各种 T 细胞亚群,其在 RA 中起着不同的作用[7-9]。Chen 等[10]研究发现 RA 患者的滑膜组织中低氧诱导因子-1α ( hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达水平升高,HIF-1α与 Notch-1 和 Notch-3 信号通路可以激活 RA 滑膜成纤维细胞进而参与 RA 的发展。

因此,本研究采用小干扰 RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默 HIF-1α 的表达,分析其对胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠的治疗作用及对 CIA 小鼠脾细胞中 T 细胞亚群的影响,探讨 HIF-1α作为治疗 RA 新靶点的可能。

1 材料与方法

1.1实验动物 50只5周龄的DBA/1小鼠,雄性,购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司,体重约20 g。实验获包头医学院第一附属医院医学伦理委员会批准,严格按照动物伦理学准则进行。

1.2试剂及仪器 完全弗氏佐剂、牛Ⅱ型胶原购自美国 chondrex 公司,CD4 单克隆抗体、CD25单克隆抗体、IFN-γ单克隆抗体、IL-10 单克隆抗体、FOXP3 单克隆抗体、IL-17 单克隆抗体、细胞内固定和破膜缓冲液组合均购自 eBioscience 公司,流式细胞仪购自美国 BD 公司,PMA/Ionomycin mixture(250 X)(佛波酯/离子霉素混合物)、BFA/Monensin Mixture(250 X)(布雷非德菌素 A /莫能霉素混合物) 购自联科生物。

1.3实验方法

1.3.1建立胶原诱导关节炎小鼠模型 将牛Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂在冰上混合乳化,于 DBA/1 小鼠尾根部皮下注射上述乳化成功的胶原和完全弗氏佐剂混合物进行初次免疫。21 d 后进行第二次免疫,28 d 小鼠的关节会出现红肿,即造模成功。

1.3.2HIF-1α-siRNA 载体的构建和病毒的制备及鉴定 针对HIF-1α的序列并参考文献设计一段 siRNA 序列,序列为 5′- TGGATAGC GATATGGTCAAT-3′,阴性对照的序列为 5′- TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,送到北京合生生物科技有限公司构建载体,并转染 293T 细胞制备病毒,病毒滴度分别为 5.53×1010PFU/mL 和 1.58×1011PFU/mL。

1.3.3HIF-1α干预 CIA 小鼠 将 CIA 小鼠随机分成3组,同时设置空白对照组,即没有进行造模的DBA/1小鼠;CIA模型组:造模成功的DBA/1小鼠;阴性对照组:CIA小鼠尾静脉注射阴性对照载体;HIF-1α-siRNA组:CIA小鼠尾静脉注射HIF-1α-siRNA载体,每周1次,共4次。实验结束后,处死小鼠。

1.3.4HE染色检测小鼠踝关节的病理改变 处死小鼠,取小鼠的其中一条后腿,PBS清洗,浸泡在含4 %多聚甲醛的冻存管中,送至武汉赛维尔生物科技有限公司进行HE染色并拍照。

1.3.5流式细胞术检测小鼠脾细胞中T淋巴细胞亚群的分化情况 实验结束,处死小鼠,取脾组织,用含双抗的PBS洗涤,研磨,细胞筛过滤,1 000 rpm离心5 min,加入3 mL RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀,后移到培养皿中,加入PMA/Ionomycin和BFA/Monensin,37 ℃ 5 % CO2培养箱中培养14 h后收集细胞至流式管中,PBS洗涤并重悬细胞,离心弃上清,加入固定破膜液500 μL,吹匀,常温避光孵育30 min,离心弃上清,加入透化液500 μL,吹匀,常温避光孵育30 min。离心弃上清,PBS重悬细胞,将其中一管细胞分成8管,对应每管加CD4+IFN-γ+、CD4+IL-10+、CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+及同型对照各1 μL,轻弹混匀,常温避光孵育30 min,剩余小鼠的脾细胞,均分成4个流式管,每管加入CD4+IFN-γ+、CD4+IL-10+、CD4+CD25+FOXP3+、CD4+IL-17+各1 μL,常温避光孵育30 min。PBS洗涤并重悬细胞,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群分化情况。

2 结果

2.1小鼠踝关节的病理变化及淋巴细胞的浸润情况 空白组小鼠踝关节结构正常,没有炎性细胞的浸润,模型组和阴性对照组小鼠踝关节出现明显的淋巴细胞浸润、滑膜增生明显。HIF-1α-siRNA 组小鼠踝关节炎症细胞浸润和滑膜增生减轻,踝关节病理损伤得到一定的缓解。见图 1。

图1 小鼠关节病理变化

2.2脾细胞中Th1细胞和Th2细胞的比例变化 模型组小鼠脾细胞中CD4+IFN-γ+Th1细胞的比例明显升高,与空白组小鼠比较,差异有统计学意义(P<0.05);CD4+IL-10+Th2细胞的比例变化不明显。HIF-1α-siRNA组小鼠脾细胞中CD4+IFN-γ+Th1细胞的比例明显下降,与阴性对照组和CIA模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),CD4+IL-10+Th2细胞的比例有上升的趋势,但变化没有明显的差异。见图2、图3。

图2 小鼠脾细胞中 Th1 细胞的变化(n=8)

图3 小鼠脾细胞中 Th2 细胞的变化(n=8)

2.3脾细胞中Th17细胞和Treg的比例变化 模型组小鼠脾细胞中CD4+IL-17+Th17细胞的比例明显升高,与空白组小鼠比较,差异有统计学意义(P<0.05);CD4+CD25+FOXP3+Treg的比例虽然呈上升的趋势,但差异无统计学意义。HIF-1α-siRNA组小鼠脾细胞中CD4+IL-17+Th17细胞的比例明显下降,与阴性对照组和模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05),CD4+CD25+FOXP3+Treg的比例同样也是升高,但差异无统计学意义。见图4、图5。

图4 小鼠脾细胞中Th17细胞的变化(n=8)

图5 小鼠脾细胞中Treg的变化(n=8)

3 讨论

RA是很常见的一种自身免疫性疾病。CIA小鼠是进行临床前研究常用的一种RA动物模型,CIA小鼠与RA患者有相同的病理特征,比如滑膜炎性细胞的浸润、滑膜增生、软骨和骨破坏等。本研究的结果也显示小鼠的踝关节出现滑膜增生,炎性细胞浸润增多,说明本实验建立的CIA小鼠可以作为RA的动物模型。Feng等[11]研究显示HIF-1α在CIA小鼠的血清和滑膜中的表达是增高的。Liu等[12]发现HIF-1α-siRNA的纳米微粒在RAW264.7细胞水平有很好的抗炎作用,对CIA小鼠同样有抗炎的作用,还可以延缓骨侵蚀和软骨破坏的程度及减少破骨细胞的生成。本研究采用siRNA技术沉默HIF-1α的表达后,CIA小鼠踝关节的滑膜增生减轻,炎性细胞浸润减少,关节的结构相对完整,因此,提示HIF-1α可以成为治疗CIA小鼠或者RA的一个靶点。

那么HIF-1α如何起治疗作用的呢?有研究发现HIF-1α的过表达可以增强RA滑膜成纤维细胞导致的Th1和Th17细胞的产生,促进IFN-γ和IL-17A的分泌增多[13-14]。Th17细胞的增多和Treg数量减少或功能不足以及二者之间的失衡在RA的免疫紊乱和关节破坏中起重要作用[15-16]。Ye等[17]研究表明酪蛋白激酶2通过调控Th1细胞和Th17细胞参与RA的发病,其抑制剂则可以抑制Th1细胞和Th17细胞分化,增加Th2细胞分化而对RA起治疗作用,但它对Treg没有明显的影响作用。本研究发现CIA小鼠脾细胞中Th17细胞的比例升高,Treg的比例降低,确实证实了Th17细胞数量的增多和Treg的减少参与CIA小鼠的发病。采用siRNA技术沉默HIF-1α的表达后,小鼠脾细胞中Th17细胞的比例下降,Treg的比例升高,提示沉默HIF-1α的表达确实可以抑制CIA小鼠脾细胞中Th17细胞的分化,增加Treg的分化。此外本研究发现CIA小鼠脾细胞中Th1细胞的比例升高,Th2细胞的比例降低,提示Th1细胞数量的增多和Th2细胞的减少参与CIA小鼠的发病。本研究敲减了HIF-1α的表达后,小鼠脾细胞中Th1细胞的比例下降,Th2细胞的比例升高,提示沉默HIF-1α的表达可以减轻CIA小鼠脾细胞Th1细胞相关的炎症反应,增强Th2细胞的分化能力。

综上所述,CIA小鼠是研究RA的常用动物模型,T细胞亚群可以参与RA的发生和发展,靶向HIF-1α不仅可以降低CIA小鼠脾细胞中Th1细胞和Th17细胞的比例,而且还可以升高Treg和Th2细胞的比例,从而成为治疗RA的靶点。