基于网络药理学探讨封髓丹治疗蛋白尿的分子机制

张艳燕，于子洋，崔伟锋，马笑凡，潘玉颖，王晓丽，李星锐*

1 河南医学高等专科学校，郑州 451191；2 北京中医药大学中医学院，北京 100029；3 河南省中西医结合医院，郑州 450004

近年来，慢性肾脏病（chronic kidney diseases，CKD）由于发病率高、知晓率低，已成为人类健康的主要威胁之一。蛋白尿作为CKD 进展的独立危险因素，对其进行有效控制有助于延缓CKD进展。封髓丹始载于《御药院方》，该书由元代医家许国祯编撰。《御药院方》中述封髓丹由黄柏、缩砂仁、甘草组成，言其功用为“降心火、益肾水”［1］。清代医家郑钦安所撰的《医理真传》中述封髓丹由黄柏、砂仁、甘草组成，“黄柏味苦入心，禀天冬寒水之气而入肾……甘草调和上下，又能伏火，真火伏藏……黄柏之苦，合甘草之甘，苦甘能化阴。西砂之辛，合甘草之甘，辛甘能化阳。阴阳合化，交会中宫，则水火既济。”［2］封髓丹加减在治疗慢性咽炎［3］、口腔溃疡［4-6］、遗精［7］、痤疮［8］、心悸［9］、便秘［10］、早泄［11］、糖尿病和对抗激素不良反应［12-13］等方面疗效确切。清代医家吴谦编修的《医宗金鉴》曾详细描述封髓丹的组成和配伍意义，并赞其为“固精之要药”［14］。李培旭主任医师根据多年临床经验，提出蛋白尿的病机是各种原因引起的肾失封藏、精微不固而外泄，辨证应用封髓丹加减在治疗蛋白尿方面取得了较好的疗效［15］。目前，关于应用封髓丹治疗蛋白尿的报道较少，作用机制仍待进一步探索，本研究运用网络药理学和分子对接技术，探索封髓丹治疗蛋白尿的分子作用机制，为封髓丹治疗蛋白尿提供科学依据，也为治疗蛋白尿相关药物的开发提供新思路和参考。

1 资料与方法

1.1 封髓丹活性成份的挖掘与筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）查找封髓丹的活性成份，在数据库中分别输入黄柏、甘草、砂仁，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似度（druglike properties，DL）≥0.18 为条件筛选所得到的活性成份，得到3 味中药的潜在活性成份。

1.2 封髓丹活性成份作用靶点信息的收集

将黄柏、甘草、砂仁中的所有潜在活性成份录入TCMSP 数据库，从而得到其相应的作用靶点，然后利用UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/），选择“已被验证的”“人类的”靶点，逐个匹配得出规范化的靶点名称（即gene symbol）以便进行后续的研究。

1.3 蛋白尿相关靶点的筛选

以“proteinuria”“albuminuria”为关键词，在GeneCard 数据库（https：//www.genecards.org）、PharmGkb 数据库（https：//www.pharmgkb.org）和OMIM 数据库（http：//www.omim.org）中检索与蛋白尿相关的靶点，并在DRUGBANK 数据库（https：//www.Drugbank.ca）中寻找已获批使用临床西药的作用靶点予以补充，合并筛选得到的所有靶点并去重，得到蛋白尿相关靶点。使用Rstudio1.3.959 软件将封髓丹活性成份作用靶点和蛋白尿相关靶点进行可视化处理，靶点交集即为封髓丹治疗蛋白尿的潜在作用靶点。

1.4 “封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶点”网络构建及拓扑分析

将靶点与活性成份相关联的数据表格导入Cytoscape3.8.2 软件中，得出“封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶点”网络图，使用软件中的“Network Analyzer”功能对网络结构进行拓扑分析，以介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和度中心性（degree centrality，DC）为依据分析得到核心成份。

1.5 封髓丹活性成份-蛋白尿靶点蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）构建及分析

以gene symbol 的形式表示筛选出的封髓丹活性成份潜在作用靶点，将这些gene symbol粘贴到STRING 数据库（https：//string-db.org/）的gene symbol 栏，设置物种为“homo sapiens”，设置最低相互作用值是“highest confidence ≥0.9”，得出各靶点蛋白的相互作用参数，并导入Cytoscape3.8.2 软件构建PPI 网络图。使用“Network Analyzer”功能对其进行拓扑分析，根据BC 值、CC 值以及DC 值筛选得到核心靶点。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

使用R 语言对封髓丹治疗蛋白尿的潜在作用靶点分别进行GO 富集分析和KEGG 富集分析，筛选条件是P≤0.01。然后按照P值从小到大进行排列，将排名靠前的条目可视化，从而找到封髓丹治疗蛋白尿涉及的生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及相关信号通路。

1.7 分子对接验证

分子间的相互识别作用可以通过几何匹配和能量匹配实现，在药物分子发生反应时，分子与靶标能够在特定的部位产生契合，并通过调整构象而获得稳定的复合结构，这个过程就是分子对接。如果封髓丹中的核心成份能与核心靶点结合成稳定的复合结构，就能从一定程度上验证封髓丹是可以通过这些核心成份发挥治疗蛋白尿的作用的，提高本研究结果的可靠性。一般情况下，当Docking Score的绝对值高于4.25 时，通常认为分子与靶点具有一定的结合能力；当Docking Score 的绝对值高于5.0时则认为二者结合能力较强；当Docking Score 的绝对值高于7.0 时则表示二者结合能力很强［16］。

将核心靶点输入PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）获得核心靶点的蛋白质结构，利用PyMol1.8 软件去除水分子及分离配体，然后加氢、计算出总电荷并设置原子类型，操作结束后将文件保存为“pdbqt”格式，即为受体文件。已筛选的核心成份需在Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载结构文件，通过Chem3D19.0 软件将其进行能量最小化后保存为mol2 格式，使用Autodock Tools1.5.6 软件设置可旋转键，然后把文件保存为“pdbqt”的格式，即为配体文件。利用Autodock-vina1.1.2 软件将保存好的“pdbqt”格式的配体文件以及受体文件进行分子对接。使用PyMol1.8 软件对对接结果实现可视化，构建出所需要对接的互相作用样式图。

2 结果

2.1 封髓丹活性成份筛选

在TCMSP 数据库中共筛选到139 个符合条件的封髓丹活性成份，其中黄柏37 个、甘草92 个、砂仁10 个。

2.2 封髓丹治疗蛋白尿潜在作用靶点

经过收集和筛选，最终获得封髓丹活性成份的作用靶点共219 个；以“proteinuria”“albuminuria”为关键词，在GeneCard、PharmGkb、OMIM、DRUGBANK 数据库中查找并去重，最终得到蛋白尿相关靶点共236 个；通过取交集去重，获得32 个封髓丹治疗蛋白尿的潜在作用靶点（图1）。

图1 封髓丹活性成份作用靶点-蛋白尿相关靶点交集韦恩图

2.3 “封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶点”网络构建和核心成份拓扑分析

将封髓丹和蛋白尿的共同靶点分子与对应的活性成份录入Excel2022 软件中，对不同药物的活性成份进行标记，建立数据库，导入Cytoscape3.8.2软件，生成含有131 个节点、275 条互相作用的边的“封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶点”网络关联图（图2）。选取BC>0.00111（中位数）、CC>0.39634（中位数）、DC>3（中位数）的活性成份为核心活性成份，这些成份可能是封髓丹治疗蛋白尿的关键活性成份。以DC 值和BC 值降序进行排列，取前12 个活性成份进行分子对接，具体数值见表1。

表1 12 个活性成份拓扑学性质

图2 “封髓丹活性成份-蛋白尿-共同靶点”网络

2.4 PPI 网络构建及拓扑分析

使用STRING 数据库和Cytoscape3.8.2 软件构建PPI 网络图，二者均能直观反映共同靶点的相互关系，且结果可相互印证。对32 个共同靶点进行拓扑分析，得到13 个核心靶点。使用STRING数据库获得封髓丹治疗蛋白尿的32 个潜在作用靶点蛋白间的相互作用关系图（图3）；从STRING数据库中导出各靶点蛋白互相作用参数，再导入Cytoscape3.8.2 软件中构建含有32 个节点、228条边的PPI 网络图，采用Cytoscape3.8.2 软件中的“Network Analyzer”功能对该PPI 网络进行拓扑分析，以BC>0.01366（中位数）、CC>0.65270（中位数）、DC>14.5（中位数）进行筛选，得到NOS3、SERPINE1、CCL2、TP53、ICAM1、IL1B、MMP9 等13 个核心靶点蛋白（表2），这些靶点可能在封髓丹治疗蛋白尿中发挥重要作用。

表2 13 个核心靶点蛋白的拓扑学性质

图3 封髓丹治疗蛋白尿的靶点PPI 网络（STRING 数据库）

2.5 GO 和KEGG 富集分析

使用R 语言对封髓丹治疗蛋白尿的潜在作用靶点进行GO 富集分析，共获取1321 个GO 条目。涉及BP 共1229 个，主要涉及细菌源分子（molecule of bacterial origin）、脂多糖（lipopolysaccharide）和营养水平的反应（response to nutrient levels）等方面；涉及CC 共15 个，涉及转录调节复合体（transcription regulator complex）、膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）等方面；涉及MF 共77 个，主要涉及四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、血红素结合（heme binding）、丝氨酸型内肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）等。

通过KEGG 信号通路富集，以P<0.01 为条件进行筛选后共获得48 条通路，按照P值从小到大排列，对排名前20 的条目做可视化操作（图4）。通路主要涉及脂质与动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathyway in diabetic complication）、流体切应力与动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）等。

图4 封髓丹治疗蛋白尿核心靶点的KEGG 富集分析

2.6 分子对接验证

将PPI 网络中DC 值排名前5 的靶点蛋白输入PDB 数据库查找蛋白结构，由于SERPINE1 蛋白的PDB 结构未查及合适配体，故不作分子对接验证。将关键靶点蛋白NOS3、CCL2、TP53、ICAM1 分别与排名前3 的关键化合物槲皮素、山柰酚、甘草宁B 进行分子对接验证。结果显示，化合物与靶点结合分值均大于7.0，提示关键活性成份与关键靶点结合性很强，封髓丹对蛋白尿有直接治疗作用（表3）。选择与4 个核心靶点蛋白具有最低结合能的药物活性成份进行分子对接可视化处理（图5）。

表3 封髓丹中活性成份与核心靶点分子对接结合分值 分

图5 封髓丹活性成份-靶点作用模式图

3 讨论

CKD 可引发心血管疾病并增加其死亡风险，还可提高糖尿病和高血压的发病率，严重影响患者健康［17］。蛋白尿与肾小球硬化、肾小管损伤密切相关，可最终引发慢性肾功能不全，减少蛋白尿可有效延缓慢性肾功能不全的发生发展［18］。中医典籍中并无“蛋白尿”这一说法的记载，根据其临床症状，多属于“尿浊”“精浊”“膏淋”等［19］。现代研究认为，蛋白质可归类于中医“精微”的范畴。《素问·六节藏象论》云［20］：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也。”蛋白尿的产生与肾的封藏功能息息相关［21］，肾失封藏、精微不固、脂浊下泄是蛋白尿的形成原因。网络药理学具有多靶点、系统性、动态性、整体性的特点［22］，与封髓丹成份复杂、多途径、多靶点治疗疾病的特点相符合，是探讨封髓丹治疗蛋白尿分子机制的重要工具之一。

封髓丹的主要活性成份槲皮素、山柰酚等黄酮类化合物具有抗炎、清除自由基、抗病毒、调节免疫功能、抗氧化、抗癌等多种药理作用［23-24］。槲皮素还可改善转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞纤维化、抑制TGF-β1 诱导的肾小球足细胞转分化等作用，治疗肾病蛋白尿疗效较佳［25-26］。山柰酚在癌症、肥胖、糖尿病等多种疾病模型中都显示出抗氧化、抗炎的作用，并能够有效改善糖尿病模型小鼠的肾脏炎症、肾小管上皮细胞纤维化和肾功能障碍［27-28］。另有研究表明，山柰酚可有效降低糖尿病肾病模型大鼠的蛋白尿含量，且酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）结果显示白介素-1β（interleukin—1β，IL-1β）、IL-18、IL-6 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的含量也显著降低，提示山柰酚可抑制糖尿病肾病模型大鼠的炎症反应［29］。

PPI 网络图提示NOS3、SERPINE1、CCL2、TP53、ICAM1、IL1B、MMP9 等可能是封髓丹治疗蛋白尿的潜在关键靶点，多集中于调节血管功能、炎症因子、癌症等方面。NOS3基因又称eNOS基因，其蛋白表达水平的改变是CKD 中糖尿病肾病发生和发展的重要原因之一［30-32］。C-C 基序趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）是微生物感染和组织损伤过程中免疫细胞聚集的重要中介［33］，是糖尿病肾病发生发展的重要因素［34-35］。在诊治糖尿病肾病时针对CCL2 进行治疗可以取得更好的疗效［36］，因此，封髓丹对糖尿病肾病可能有较好的治疗作用，其作用机制可能是通过其有效活性成份槲皮素和山柰酚调节关键靶点CCL2、NOS3、SERPINE1 的生物活性，发挥治疗蛋白尿的作用。

封髓丹参与通路主要富集在TNF、流体切应力与动脉粥样硬化、脂质与动脉粥样硬化、AGERAGE 等相关的信号通路。晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）在体内主要通过与其受体（receptor of AGEs，RAGE）结合而引起病变，在正常健康的人体中，RAGE 主要在肾脏中表达，但表达量较低［37］。有研究表明，RAGE敲除小鼠的糖尿病肾病症状显著改善。在链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）注射致糖尿病的RAGE敲除小鼠中，RAGE 缺失与蛋白尿减少、肾小球硬化减少和血清肌酐浓度降低密切相关［38］。本研究在TNF 信号通路上主要富集到CCL2等基因，这些信号通路靶点主要是炎症趋化因子，提示封髓丹主要通过调节免疫信号通路、调整机体炎症因子的表达、控制炎症反应从而治疗蛋白尿。

分子对接结果表明，封髓丹中排名前3 的活性成份（槲皮素、山柰酚、甘草宁B）与排名前5 位的靶蛋白中的4 种结合强度依次为：NOS3>TP53>ICAM1>CCL2，且提示槲皮素与NOS3、TP53、ICAM1 有良好的相互作用，山柰酚与ICAM1、NOS3 有良好的相互作用。分子对接进一步证实了网络药理学研究的结果。

综上所述，基于网络药理学研究和分子对接结果，封髓丹可能通过其有效成份槲皮素和山柰酚调节NOS3、TP53、ICAM1、CCL2 等靶点蛋白的生物活性和AGE-RAGE、TNF 等免疫信号通路以保护肾脏、治疗蛋白尿。但本研究尚存在不足，例如网络药理学和分子对接技术因未考虑药物剂型、封髓丹中的君臣佐使配伍关系、药物煎煮方法及时间等因素，其结果的可靠性还有待进一步证实，未来还需从动物及细胞层面验证本研究结果的科学性。