弓形虫棒状体蛋白15 的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

蒋鹏，王泽祥，车亮，王由森，孙晓林

（甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070）

弓形虫病是由弓形虫寄生于哺乳动物、鸟类、海洋哺乳动物和人类而引起的一种原虫病，分布于全球除南极以外的所有地区［1］。弓形虫的生活史复杂，感染形式主要有3 种，分别是包含子孢子的卵囊、速殖子和包含缓殖子的包囊。包含缓殖子的包囊通常存在于慢性感染病例的脑组织、骨骼肌、内脏，能够逃避宿主的免疫系统、抵抗药物作用、转化为具有毒力的速殖子［2］。速殖子通常存在于慢性感染病例体内，以内出芽法在有核细胞内生殖，在速殖子感染的细胞内会形成纳虫泡，速殖子在纳虫泡内复制。纳虫泡能够保护速殖子免受宿主细胞溶酶体的降解，对弓形虫速殖子在细胞内的生长是必需的［2］。

弓形虫速殖子的顶质体主要由3个分泌性细胞器组成，分别是棒状体、致密颗粒和微线体。棒状体是顶复门原虫共有的分泌性细胞器。弓形虫棒状体呈棒球状，由前端的颈部和后端的球部构成［3-4］。弓形虫棒状体占据整个虫体细胞总体积的1%～30%，在速殖子入侵宿主细胞和纳虫泡的生物合成中发挥作用。棒状体蛋白在弓形虫多个阶段虫体入侵宿主细胞过程中发挥作用，它们对于弓形虫在宿主细胞内的生存是必需的［5-8］。学者对弓形虫棒状体蛋白质组学的研究表明，弓形虫棒状体包含38个蛋白质，目前发现11 个位于棒状体球部、9 个位于棒状体颈部［9-11］。许多棒状体蛋白是弓形虫的毒力因子，在弓形虫的致病性方面发挥重要作用。ROP5、ROP16和ROP18 是棒状体蛋白激酶，它们具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性，在弓形虫虫体入侵宿主细胞和调节宿主细胞过程中发挥关键作用［4，12-14］。

ROP15 是经过二维电泳鉴定出的一个弓形虫棒状体蛋白，该蛋白与人源抗弓形虫速殖子血清和羊源抗弓形虫速殖子血清具有良好的反应性［15］。ROP15基因缺失的RH虫株弓形虫速殖子在小鼠体内和体外培养细胞中的感染和增殖能力受到影响，但是ROP15缺失RH虫株速殖子对小鼠的致病性无影响［16］。因此，ROP15具有作为弓形虫病诊断抗原和疫苗免疫候选分子的潜在可能。本研究运用RTPCR 技术克隆弓形虫RH 虫株速殖子ROP15基因，对弓形虫RH虫株速殖子ROP15进行原核表达及纯化，为进一步研究ROP15在弓形虫病诊断和疫苗免疫方面的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 虫株、菌株、载体及试验动物

弓形虫RH虫株速殖子由本实验室保存，系液氮中的长期保种。原核表达载体pGEX-4T-1 和大肠杆菌（E.coil）DH5α、BL21（DE3）为本实验室保存。BALB/c 小鼠、新西兰大白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要仪器、试剂及耗材

DDY-31A型稳压稳流电泳仪、微型垂直电泳槽（北京六一厂），电热恒温培养箱（上海精密实验设备公司）、超声波破碎仪（浙江宁波新芝生物科技股份有限公司）、超净工作台 （苏净集团安泰公司）、电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）、脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司） 、低温离心机（美国Thermo）、超微量紫外线分光光度计（杭州宏麟春科技有限公司）。限制性内切酶BamH I、XhoI购自NEB（北京）有限公司New England Biolabs （Beijing） LTD；反转录试剂盒PrimeScript™ RT Master Mix、T4 DNA连接酶、高保真DNA聚合酶、dNTPs、质粒提取试剂盒、IPTG均购自大连宝生物工程有限公司；DNA Marker、RNA 提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购自美国Axygen 公司；GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂为南京金斯瑞有限公司产品。离心管、移液器吸头均购自甘肃泰科生物科技有限公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.3 弓形虫RH虫株速殖子收集及RNA提取

将液氮中保存的弓形虫RH虫株速殖子复苏，腹腔接种小鼠，连续传代3 代后无菌操作收集小鼠腹水，3 000 r/min 离心15 min，弃去上清，使用PBS 清洗3次，按试剂盒说明书提取速殖子RNA。

1.4 引物设计及合成

根据已发布的弓形虫RH虫株ROP15基因开放阅读框（ORF）序列（NCBI 登录号 DQ096561.1），运用软件Oligo设计引物，上下游引物分别引入BamHⅠ和XhoI限制性内切酶位点，引物由上海生物工程有限公司合成。上游引物RP15-F：5’-CGGGAT CCATGCTGAAAACGACACCTGCATT-3’；下游引物RP15-R：5’-CCGCTCGAGGTCATAGA CTTACCCCGAGGGACT-3’。

1.5 ROP15基因的RT-PCR扩增

以提取的弓形虫RH 虫株速殖子RNA 为模板，对其进行反转录，合成cDNA，再以cDNA 为模板，用引物进行PCR扩增。反应体系为（50 μL）：RP15-F、RP15-R 各2 μL，cDNA 模板5 μL，PCR Green Mix 25 μL，灭菌蒸馏水16 μL。PCR 循环参数为：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，68 ℃ 45 s，72℃1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。反应结束后，PCR产物应用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

1.6 pMD-19T-ROP15 基因克隆载体的构建和测序

将琼脂糖凝胶电泳鉴定正确的PCR 产物应用DNA 胶回收试剂盒回收纯化，连接pMD-19-T 载体，转化至大肠杆菌（E.coil）DH5α感受态细胞，菌液PCR 筛选阳性克隆，将阳性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司测序分析，测序正确的单克隆扩大培养进行后续试验。

1.7 pGEX-4T-ROP15原核表达载体的构建

使用BamH I和XhoI双酶切pGEX-4T-1原核表达载体和ROP15基因，胶回收双酶切后的载体片段和ROP15 基因。将纯化后的载体片段和ROP15基因连接，16 ℃过夜，然后转化至大肠杆菌（E.coil）DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性单菌落，提取质粒进行BamH I和XhoI双酶切鉴定，双酶切产物应用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确的单菌落送至送至上海生工生物工程有限公司测序分析，测序正确的单菌落用于后续诱导表达。

1.8 重组ROP15的诱导表达

测序鉴定正确的单菌落扩大培养后提取重组质粒pGEX-4T-ROP15，将其转化至大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，挑取单菌落接种至含Ampr的LB液体培养基中，置于恒温振荡培养箱中37 ℃扩大培养，于D600达到0.6 时，加入IPTG （终浓度为1 mmol/L），而后于16 ℃，200 r/min 振荡培养过夜，5 000 r/min离心收集菌体沉淀。使用PBS悬浮菌体沉淀，冰浴超声破碎菌体沉淀（30 min，超声5 s，间歇9 s）至溶液透明，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，分离上清与沉淀，以未诱导菌体作为对照，聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定重组ROP15在大肠杆菌BL21（DE3）中的诱导表达情况。

1.9 原核表达ROP15的纯化

收集诱导表达的ROP15重组蛋白上清液，运用GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化可溶性ROP15 重组蛋白，操作步骤如下：GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽琼脂糖树脂装柱，0.7 cm×2.5 cm，柱床体积为1 mL；使用缓冲液Binding Buffer 平衡5 个床体积，流速为1 mL/min；使用10 mL ROP15 重组蛋白上清液0.45 μm 滤膜过滤后上样，流速为 1 mL/min；使用Washing Buffer再洗10个床体积，流速为1 mL/min；使用Elution Buffer 洗脱，流速为 1 mL/min，收集洗脱峰。纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，于-20 ℃保存纯化后的ROP15重组蛋白。

1.10 ROP15多克隆抗体的制备

应用弗氏不完全佐剂将纯化后的ROP15 重组蛋白后进行乳化（体积比1∶1），对新西兰大耳白兔背部皮下多点注射进行免疫，在初次免疫后于第2、4、6、8 周应用弗氏不完全佐剂乳化ROP15 重组蛋白，进行加强免疫。末次免疫前耳缘静脉采集新西兰大白兔血液，分离血清测定抗体效价，在第9周终止免疫，心脏采集新西兰大白兔血液，4 000 r/min 离心20 min，分离血清，于-20 ℃保存备用。

1.11 Western-blot

收集弓形虫RH 株速殖子，提取总蛋白后，取ROP15 重组蛋白和总蛋白各15 μL 进行SDSPAGE电泳分析。转膜、封闭后，应用制备的多克隆抗体血清为一抗震荡孵育2 h，TBST 缓冲液洗涤3 次，然后应用HRP 标记的羊抗兔IgG 为二抗孵育1 h，TBST 缓冲液洗涤3 次，最后加入ECL 显色2 min，观察分析结果。

2 结果与分析

2.1 弓形虫RH 虫株速殖子ROP15 基因的RTPCR扩增

以弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板，经RTPCR 扩增后进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得924 bp基因片段（图1），与已发布的弓形虫RH 虫株ROP15 ORF 序列长度一致。对pMD-19T-ROP15重组克隆载体测序，测序结果与弓形虫RH 虫株ROP15 ORF序列一致。

图1 RT-PCR克隆ROP15基因结果Figure 1 The result of cloning ROP15 gene by RT-PCR

2.2 pGEX-4T-ROP15原核表达载体的鉴定

提取pGEX-4T-ROP15 质粒进行BamH I 和XhoI 双酶切鉴定，获得大小约为4 969 bp 和924 bp的2个基因片段（图2），与预期结果一致。重组质粒测序结果显示插入的ROP15基因无缺失和突变，表明pGEX-4T-ROP15原核表达载体构建成功，可以用于后续ROP15诱导表达。

图2 原核表达质粒pGEX-4T-ROP15双酶切结果Figure 2 The result of pGEX-4T-ROP15 digested by EcoR I and BamH I

2.3 ROP15的可溶性原核表达

ROP15蛋白诱导表达产物经SDS-PAGE 电泳鉴定，于相对分子量为59 ku处出现1条蛋白条带，与GST-ROP15 重组蛋白预期分子质量相符合，且在诱导表达产物的上清液中存在大量的GST-ROP15重组蛋白（图3）。

图3 pGEX-4T-ROP15诱导表达产物的SDS-PAGE分析Figure 3 The analysis of induced expression products of pGEX-4T-ROP15

2.4 ROP15可溶性蛋白的纯化

将纯化产物应用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，结果显示纯化后的蛋白纯度良好（图4）。

图4 纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析Figure 4 The analysis of purified ROP15

2.5 Western-blot鉴定

重组ROP15蛋白和弓形虫RH株速殖子总蛋白经SDS-PAGE 分离、转膜、封闭后，以制备的ROP15多克隆抗体血清为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG 为二抗，应用Western-blot 鉴定重组ROP15 蛋白和弓形虫RH 株速殖子总蛋白与多克隆抗体的反应性，结果显示反应性良好（图5）。

图5 ROP15多克隆抗体的Western-blot分析Figure 5 The Western-blot analysis of polyclonal antibody against ROP15

3 讨论

弓形虫棒状体基因家族编码的棒状体蛋白的生物学功能在弓形虫的虫体毒力和致病性方面发挥重要作用，因此，棒状体蛋白已经成为近年来学者研究弓形虫病免疫预防的潜在靶标。已经有多种类型的研究聚焦于弓形虫免疫抗原的筛选，这些筛选出的抗原中就包括多个棒状体蛋白，而且数个棒状体蛋白对小鼠弓形虫病免疫效果已得到评价，如ROP2、ROP16、ROP18 等［4］。基因克隆和原核表达技术已经在弓形虫棒状体蛋白、羊口疮病毒ORF19 基因，小反刍兽疫N5蛋白等研究中有所应用［4，17-18］。

棒状体蛋白15（ROP15）、烯醇化酶2（enolase 2）、棒状体蛋白4（ROP4）、致密颗粒蛋白14（GRA14）、棒状体蛋白9（ROP9）是同时被鉴定出的与人和羊阳性血清反应的弓形虫抗原。ROP4是弓形虫速殖子在分裂过程中分泌至细胞外的Ⅰ型跨膜蛋白，其与速殖子的纳虫泡膜相关，而且在感染细胞内发生磷酸化［19］。ROP2 和ROP4 重组抗原免疫小鼠，能够诱导小鼠产生较显著的体液免疫反应［19］。ROP4也被认为是小鼠慢性弓形虫病合适的候选抗原［20］。ROP9是弓形虫与疟原虫中同源的一个棒状体蛋白，大小约为38 ku，该棒状体蛋白在3个基因型的弓形虫速殖子中都表达，在速殖子入侵宿主细胞时由棒状体分泌，继而结合至扩张的纳虫泡膜上［21-22］。ROP16在弓形虫入侵宿主细胞时分泌至细胞内，激活宿主的转录因子STAT3和STAT6［23-24］。ROP47 从速殖子分泌后转运至宿主细胞核内，ROP47和ROP48基因缺失对Ⅱ型虫株速殖子在小鼠体内和体外的生长并无明显影响［25］。ROP1在脑包囊生长的小鼠体内被鉴定出，ROP1重组蛋白被认为是检测人急性弓形虫病患者体内弓形虫特异性IgG抗体的潜在靶标［26-27］。

2017 年，国内有学者运用基因敲除技术构建了弓形虫Ⅰ型强毒株15个棒状体蛋白的缺失株，评价了这些缺失株在小鼠体内和体外的增殖能力，提示ROP15可能在弓形虫的生活史中发挥作用［16］。本研究克隆弓形虫强毒株RH 虫株速殖子ROP15 基因，表达和纯化ROP15重组蛋白，为进一步研究弓形虫诊断试剂和疫苗的研发以及ROP15 在弓形虫入侵宿主细胞的作用提供准备。

4 结论

研究成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因，大小为924 bp，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-ROP15，诱导表达获得了约59 ku 的可溶性ROP15 蛋白，成功纯化，获得了纯度较高的重组ROP15蛋白，并制备了多克隆抗体。