兽用灭活疫苗的研究进展

洛桑江白

（西藏自治区兽医生物药品制造厂 拉萨 850000）

从18 世纪后期发现接种牛痘可以让人类免受天花感染开始，疫苗在人类和动物的生命健康发挥了关键作用。疫苗接种是预防传染病最具成本效益的干预策略之一，是防止各种传染病传播的最有效、最经济的手段[1]。

疫苗根据制备程序及疫苗研发的进度，可以大致分为：常规疫苗如弱毒疫苗（活疫苗）、灭活疫苗、类毒素疫苗；基因工程疫苗如亚单位疫苗、活载体疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗，以及目前仍处于实验室研究阶段的转基因植物可食用疫苗和抗独特型疫苗等。而灭活疫苗制备具有研发耗时短、工艺相对统一、简单，免疫过程中无感染毒力、使用安全等优点，已经在多种传染病的预防上发挥了很好干预作用[2]。但是灭活疫苗可能会出现病毒抗原的损害，降低疫苗免疫活性及维持时间短等弊端需要进一步优化工艺流程，选用引发更持久性的免疫反应的佐剂和增加发酵的活菌数及增强疫苗免疫力的培养基，研制多联灭活疫苗，减少单苗多次免疫造成的应激反应等途径，研制出免疫持续时间长，免疫保护范围广的灭活疫苗，创造更多的经济价值具有重大意义。

1 优化工艺流程

以重组禽流感灭活疫苗为例，基于甲醛进行疫苗灭活时，病毒株蛋白中存在核酸物质，对甲醛反应较为灵敏，与甲醛灭活试剂结合容易造成病毒体中的蛋白质凝结，造成很多游离甲醛的存在，由于禽流感病毒具有生物特性，蛋白质就是主要结构物质，一旦病毒株蛋白质发生凝结，疫苗作用将大大降低[3]。在使用甲醛试剂完成病毒原液处理后，病毒株已经具备了灭活性。因此，可以增加离心工艺处理环节，解决病毒株蛋白质的破坏。通过离心仪器设备，将原液作为处理对象，对已经完成基本灭活的病毒抗原原液进行离心。应至少保证对同一原液离心2 次，确保离心处理彻底[3]。在离心操作后用生物膜技术实施过滤，病毒抗原原液提纯完成后，再次使用甲醛试剂来进行二次灭活。

崔松奇等[4]从狂犬病冻干灭活疫苗的下游工艺规模化生产试验得知，上样量多少与洗脱流速对凝胶过滤纯化有一定的影响。加样量多了，影响分离效果；加样量少了，生产效率低。经试验，当加样量为5%～8%柱床体积时，杂蛋白峰与病毒峰可以完全分开，杂蛋白去除率93%以上。洗脱速度也是柱层析获得良好分离的重要条件。一般来讲，洗脱流速慢一点，样品与凝胶基质充分平衡，分离效果更好，但洗脱流度太慢会造成样品扩散，区带变宽，降低分辨率，且生产时间会延长。而随着洗脱流速的越来越大，无论是抗原回收率还是杂蛋白去除率效果均不佳。因此，实验中应该根据实际情况来选择适合的洗脱流速。纯化时加样量为8%柱床体积，洗脱流速为30～40 cm/h 的线性流速，通过验证可以满足规模化生产。

2 选用优良的佐剂

疫苗组分中的佐剂具有抗原储存库效应，从而辅助增强免疫反应。铝胶佐剂是较为常用的疫苗佐剂之一，常规铝胶佐剂偶有注射部位红疹、皮下结节、接触性过敏等不良反应。寇亚楠等[5]研究发现将铝胶佐剂纳米化后，包裹或表面结合抗原的纳米粒子，能使蛋白抗原的表面充分暴露，铝胶佐剂的表面积会增加，吸附能力更强。因此提高抗原的靶向投递，降低不良反应。抗原结构变的更稳定，促进淋巴结的摄取，能引起强烈的特异免疫反应。郭幸娟[6]采用全混流反应器通过实时调控pH 值和反应时间两个物理参数来保证反应体系始终是连续和恒定的，实现氧化铝纳米颗粒连续、可控的合成过程。最终获得了具有高度均一性的棒状氧化铝纳米颗粒。在酸性环境下生成的氧化铝纳米棒表现出良好的稳定性和蛋白质吸附能力。表明该棒状的氧化铝可引发更持久性的免疫反应。与商业化佐剂相比，采用全混流反应技术连续生成的全混流反应纳米棒羟基含量较高，结晶度较低，产生较强佐剂效应。寇亚楠等[5]采用HI 和ELISA 方法证实以纳米铝胶为佐剂，制备的PPV 灭活疫苗较其他佐剂疫苗组能显著增强猪只的机体免疫效果，并刺激机体较早产生抗体，且免疫保护效果较好。

3 选用合适的培养基

灭活疫苗生产过程中，不同培养基组成对其发酵的活菌数及疫苗的免疫力有一定的影响。孙承文等[7]采用单因素试验、响应面试验法对维氏气单胞菌发酵培养基优化组合，并与基础培养基的发酵活菌数、制备的灭活疫苗免疫效力进行比较，经过验证试验，在优化发酵培养基（磷酸二氢钾2.0 g/L，胰蛋白胨10.8 g/L，牛肉膏3.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，硫酸镁0.4 g/L，NaCl 5.0 g/L）条件下，维氏气单胞菌活菌数比基础培养基增幅43.13%；制备的灭活疫苗相对保护率为77.78%，比基础培养基提高了14.81%。通过对维氏气单胞菌发酵培养基的优化，可以获得低成本、优质高效的发酵菌液。笔者所在单位吉哈利等[8]利用羊链干粉培养基（杭州微生物试剂有限公司）与缓冲肉汤培养基，两种不同的培养基培养羊败血性链球菌株C55001、C55002，结果羊链干粉培养基培养的菌株活菌量达20×108CFU/mL，显著高于单位常用的缓冲肉汤培养基活菌量；通过实验发现该疫苗具有良好的免疫安全性与免疫原性，产生极好的免疫效果。

4 研制多联灭活疫苗

随着养殖业的规模扩大及舍饲养殖模式的普及，牲畜疾病经常混合感染，耐药菌株增多，难以进行针对性用药。因此，研制多联灭活疫苗很有必要。

吕云扬[9]用奶山羊肺脏病料中分离出的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌。用多杀性巴氏杆菌中的强毒株PM01、溶血性曼氏杆菌中的强毒株MH01、大肠杆菌强毒株EC01；用5%血清的BHI 肉汤培养的PM01、MH01 和LB 琼脂肉汤培养的EC01，经灭活、浓缩纯化，制备了两种佐剂的多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌三联灭活疫苗。经过评估，疫苗免疫效果良好，可以有效预防呼吸系统疾病，有推广应用价值。吕茂杰[10]用PCV2 杆状病毒载体表达的副猪嗜血杆菌4 型和5 型抗原、猪肺炎支原体抗原和Cap 蛋白抗原制备工艺优化，并确定三联灭活疫苗中的抗原最小使用量，确定制苗标准（副猪嗜血杆菌5 型抗原2.0×109CFU/头份、副猪嗜血杆菌4 型抗原4.0×109CFU/头份、猪肺炎支原体抗原100 μg/头份和Cap 蛋白50 μg/头份）。该疫苗在安全性检验中未见异常。攻毒保护试验中，免疫猪均获得80%以上的保护率，血清抗体监测中抗体全部转阳。免疫保护覆盖范围广，可一针同时防控三种主要疫病。刘月月等[11]通过反向遗传技术致弱而得到鸡新城疫疫苗株N7a、H9 亚型保护谱广的毒株SZ、鸡传染性支气管炎病毒经典疫苗株M41，制备的鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗进行了安全性和有效性研究表明，疫苗安全性良好，能产生较好的免疫效力，能有效预防鸡只感染，能减少单苗多次免疫造成的应激反应，降低免疫成本，创造更多的经济价值（HPS5 型抗原2.0×109CFU/头份，Mhp 抗原100 μg/头份和HPS4 型抗原4.0×109CFU/头份）。

5 总结与展望

近年来，随着疫苗研究的不断深入和知识经验的积累，进一步开展相应的免疫学机理和机制研究，在兽用灭活疫苗生产过程中，灭活原液增加离心处理环节、冻干疫苗选择合适的上样量和洗脱流速等优化工艺流程，选用引发更持久性免疫反应的佐剂和增加发酵的活菌数及增强疫苗的免疫力的培养基，研制多联灭活疫苗等方法获得低成本、优质高效的兽用灭活疫苗。随着养殖业的规模扩大及舍饲养殖模式的普及，能很大程度上减少单苗多次免疫造成的应激反应，降低免疫成本，创造更多的经济效益。