邻香草醛基席夫碱配体衍生物VALD-3对结直肠癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响及其作用机制

蒙玉娜，马淑萍，党春艳，薛丽，李红玲，

1.宁夏医科大学临床医学院血液科，宁夏 银川 750000；2.甘肃省人民医院肿瘤内科，甘肃 兰州 730000

研究表明，席夫碱类配合物具有抗肿瘤活性［5-6］，如在Valdien［N1，N3-bis（3-methoxysalicylidene）diethylenetriamine］基础上引入可溶性羟基基团，形成一种重要的邻香草醛基席夫碱配体衍生物VALD-3，该衍生物具有广泛的抗菌、抗病毒、抗肿瘤等生物学活性，但其抗结直肠癌的作用尚未见报道。本研究通过多种方法检测VALD-3 对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其作用机制，以期为结直肠癌的预防和治疗提供新思路，同时为临床抗癌药物研发及应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 结直肠癌细胞株HT-29 及HCT116 均购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂 VALD-3（纯度＞98%）由兰州西北师范大学宋鹏飞教授合成；DMEM 培养基购自上海源培生物科技股份有限公司；MTT 试剂及Hoechst 33258染色液均购自北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清购自美国HyClone 公司；AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司；兔抗人cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、Bcl-2 单克隆抗体、鼠抗人β-actin 单克隆抗体购及HRP 标记的山羊抗鼠及山羊抗兔IgG（H+L）均购自中国Proteintech Group，Inc.；山羊抗兔Bax单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.3 细胞培养 将HT-29和HCT116细胞用含1%青-链霉素和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，于37 ℃，含5%CO2的培养箱中培养24～48 h；用含0.25%EDTA的胰酶消化细胞并传代，取第3代细胞进行后续试验。

1.4 VALD-3 对结直肠癌细胞增殖活性影响的检测 采用MTT 法。取对数生长期的HT-29 和HCT116 细胞，血球计数板计数，接种至96 孔板，4 × 103个／（200 μL·孔），于37 ℃培养24 h；待细胞贴壁后，分别加入浓度为5、10、20、40 mg／L 的VALD-3，每个浓度设4个复孔，同时设空白对照组（加入DMSO）和阴性对照组（不加VALD-3，仅加入等量培养基），继续培养24 h；弃培养液，加入终浓度为5 mg／mL 的MTT 溶液，20 μL／孔，37 ℃孵育4 h；弃孔内液体，加入DMSO，150 μL／孔，用酶标仪检测A490，并按下式计算细胞存活率。

1.5 VALD-3 对结直肠癌细胞形态影响的检测 将对数生长期的HT-29 和HCT116 细胞接种至6 孔板，1.2×106个／孔，37 ℃培养过夜；分别加入浓度为10、20、40 mg／L 的VALD-3，同时设阴性对照组（不加VALD-3），于37 ℃作用24 h，于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.6 VALD-3对结直肠癌细胞迁移影响的检测 采用划痕试验。将对数生长期的HT-29 细胞接种至6 孔板，1.2×106个／孔，37 ℃孵育24 h；用20 μL枪头划出一道竖形划痕，无菌PBS 洗涤2 次，加入含不同浓度VALD-3（10、20、40 mg／L）的DMEM 培养基，同时设阴性对照组（不含VALD-3），于37 ℃分别培养0、24 h，拍照记录，应用Image J 软件测量划痕距离，并按下式计算细胞迁移率。

1.7 VALD-3对结直肠癌细胞凋亡影响的检测

对于高吸入压力、低压缩比的压缩机，推荐采用压缩机进、出口差压作为喘振信号的输入，同时仍然需要安装入口压力传感器。

1.7.1 流式细胞术 将对数生长期的HT-29 细胞接种至6孔板，1.2×106个／孔，37 ℃培养至细胞融合度达70%时，分别加入浓度为10、20、40 mg／L的VALD-3，同时设阴性对照组（不加VALD-3），继续孵育24 h；用不含EDTA 的胰酶消化细胞，300 ×g离心5 min，弃上清液，预冷PBS洗涤2次，加入5 μL的AnnexinVFITC 和5 μL 的PI，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7.2 Hoechst荧光染色法 将对数生长期的HT-29细胞接种至放有无菌盖玻片的6孔板中，1.2×106个／孔，37 ℃培养12 h；分别加入浓度为10、20、40 mg／L 的VALD-3，同时设阴性对照组（不加VALD-3），继续培养24 h；弃培养液，加入75%无水乙醇固定，再加入1 mL Hoechst 33258（1 mg／mL）染色液，室温避光孵育30 min；荧光显微镜下观察细胞核变化。

1.8 VALD-3 对结直肠癌细胞中凋亡相关蛋白表达水平影响的检测 采用Western blot 法。将对数生长期的HT-29 细胞接种至6 孔板，1.2 × 106个／孔，37 ℃培养至细胞融合度达70%时，分别加入浓度为5、10、20、40 mg／L 的VALD-3，同时设阴性对照组（不加VALD-3），继续孵育24 h；RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，经6%～12% SDSPAGE 分离后，转移至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉于室温封闭1.5 h；加入兔抗人cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、Bcl-2、Bax 及鼠抗人β-actin 单克隆抗体（均1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的山羊抗鼠IgG（H + L）及山羊抗兔（H+L）IgG（均1∶1 000稀释），室温孵育1 h；ECL法显色，应用Bio-Rad凝胶成像系统扫描分析，Image Lab软件计算灰度值。

1.9 统计学分析 应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验（正态分布时）或Wilcoxon秩和检验（非正态分布时），均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VALD-3对结直肠癌细胞增殖活性的影响 与阴性对照组比较，5 mg／L VALD-3组HT-29和HCT116细胞存活率差异均无统计学意义（t分别为1.462 和3.937，P均＞0.05），10、20、40 mg／L VALD-3组HT-29和HCT116细胞存活率明显下降（t=7.717～2 006.148，P均＜0.01），且呈浓度依赖性。见表1。

表1 各组结直肠癌细胞的存活率（%，±s，n=3）Tab.1 Survival rate of colorectal cancer cells in various groups（%，±s，n=3）

表1 各组结直肠癌细胞的存活率（%，±s，n=3）Tab.1 Survival rate of colorectal cancer cells in various groups（%，±s，n=3）

注：aa表示与阴性对照组比较，P ＜0.01。

组别阴性对照VALD-3（mg／L）5 10 20 40 HT-29细胞100.00 HCT116细胞100.00 98.11 76.38aa 50.65aa 44.76aa 97.54 85.63aa 73.38aa 46.43aa

2.2 VALD-3对结直肠癌细胞形态的影响 阴性对照组HT-29 和HCT116 细胞饱满、生长旺盛，形态成梭形或多边形，排列密集；VALD-3组HT-29和HCT116细胞随着VALD-3 浓度增加，细胞数目明显减少，且细胞出现不规则形态，逐渐变圆、变小，细胞碎片增多，40 mg／L VALD-3组细胞漂浮、裂解、脱落死亡。见图1。

图1 各组结直肠癌细胞形态的镜下观察（×200）Fig.1 Morphology of colorectal cancer cells in various groups under microscope（×200）

2.3 VALD-3 对结直肠癌细胞迁移能力的影响 对照组、10、20 和40 mg／L VALD-3 组HT-29 细胞划痕24 h 后迁移率分别为50.07%、8.375%、5.67%和3.82%。与阴性对照组比较，10、20和40 mg／L VALD-3组划痕迁移率均明显降低（t分别为11.215、7.596和73.780，P均＜0.01），见图2。表明VALD-3 能抑制HT-29 细胞的迁移。

图2 细胞划痕试验检测HT-29细胞的迁移能力（×200）Fig.2 Detection of HT-29 cell migration ability by cell scratch test（×200）

2.4 VALD-3对结直肠癌细胞凋亡的影响

2.4.1 流式细胞术 阴性对照组、10、20、40 mg／L VALD-3组HT-29细胞凋亡率分别为（1.2±1.36）%、（19.1±2.57）%、（24.96±5.19）%、（50.17±11.83）%。与阴性对照组比较，10、20、40 mg／L VALD-3组凋亡率均明显升高（t分别为7.902、7.254 和8.057，P均＜0.01），且呈剂量依赖性。见图3。

图3 流式细胞术检测HT-29细胞的凋亡情况Fig.3 Apoptosis analysis of HT-29 cells by flow cytometry

2.4.2 Hoechst 33258 荧光染色法 阴性对照组细胞呈均匀的低强度荧光，细胞核呈圆形或椭圆形，边缘清晰；经VALD-3作用的HT-29细胞凋亡细胞明显增多，产生强烈的亮蓝色荧光，染色质浓缩，细胞核碎裂。见图4。

图4 Hoechst 33258 染色法观察HT-29 细胞的凋亡情况（×400）Fig.4 Apoptosis analysis of HT-29 cells by Hoechst 33258 staining（×400）

上述结果表明，VALD-3可诱导结直肠癌细胞凋亡。

2.5 VALD-3 对结直肠癌细胞中凋亡相关蛋白表达水平的影响 与阴性对照组比较，5、10、20、40 mg／L VALD-3 组HT-29 细 胞 中cleaved caspase-3 和Bax 蛋白表达水平明显升高（t=2.998 ～24.901，P＜0.05），40 mg／L VALD-3组Bcl-2蛋白表达水平明显降低（t=10.035，P＜0.05）；5、10 mg／L VALD-3 组HT-29 细胞中cleaved caspase-8蛋白表达水平差异无统计学意义（t分别为0.577 和2.060，P均＞0.05），20、40 mg／L VALD-3 组明显升高（t分别为12.630 和8.064，P均＜0.01）。见图5和图6。

图5 Western blot 法检测HT-29 细胞中凋亡相关蛋白的表达情况Fig.5 Detection of expression of apoptosis-related proteins in HT-29 cells by Western blot

图6 HT-29细胞中凋亡相关蛋白的表达水平Fig.6 Expression levels of apoptosis-related proteins in HT-29 cells

3 讨论

席夫碱主要包括含有亚胺或甲胺特定基团（-RC=N-）的有机化合物，通常由氨和反应性羰基化合物缩合而成［7］。由于具有广泛的抗肿瘤作用，席夫碱及其复合物越来越受到人们的关注［8］。有研究证实，属于席夫碱基家族的Valdien 对结直肠癌和人类非霍奇金淋巴瘤具有显著的抗肿瘤作用［9-10］，但Valdien 的水溶性较差，限制了其临床应用，因此，有研究以邻香草醛基衍生物为原料合成了一种具有高水溶性的席夫碱配体VALD-3，VALD-3 对乳腺癌体内外具有抗肿瘤作用［7］。本研究通过多种体外试验探讨VALD-3对结直肠癌的抗肿瘤作用。

不可控制的细胞增殖是肿瘤进展的主要机制［11］。为探讨VALD-3 对HT-29 和HCT116 细胞的毒性作用，本研究采用MTT 法检测了VALD-3 对两种细胞增殖活性的影响，结果显示，VALD-3具有抑制HT-29 和HCT116 细胞生长的能力。与对照组比较，40 mg／L浓度VALD-3 使HT-29 和HCT116 细胞的增殖活力分别降低至44.76%和46.43%，表明VALD-3可明显抑制细胞增殖（P＜0.01）。细胞形态及划痕试验结果显示，VALD-3 明显改变了结直肠癌细胞的形态，且抑制了HT-29 细胞的迁移力（P＜0.01），表明VALD-3具有抗结直肠癌作用。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种生理过程，对调控细胞生长、增殖、分化和死亡等基本生物学过程至关重要［12］。细胞凋亡是由多种信号通路触发的诱导细胞死亡形式，其涉及基因水平调控，并诱导有序和有效地清除受损细胞凋亡［13］，也是多细胞生物体生命活动中重要组成部分，在维持组织稳态过程中发挥重要作用［14］。细胞凋亡主要受促凋亡蛋白（如Bad 和Bax）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2 和Bcl-XL）之间的平衡调节［15］。肿瘤放疗、化疗及免疫靶向治疗等均是通过诱导癌细胞凋亡达到治疗目的［16］，因此诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的重要途径之一。本研究流式细胞术检测结果显示，HT-29 细胞经不同浓度VALD-3作用24 h后，随着VALD-3浓度的增加，凋亡细胞数逐渐增多，凋亡率明显升高（P＜0.01），当VALD-3浓度达40 mg／L时，细胞凋亡率高达83.2%。另外，还可从细胞染色质和细胞核形态学评估细胞的凋亡情况［17］。本研究Hoechst 33258 荧光染色法检测结果发现，与阴性对照组比较，HT-29 细胞经VALD-3处理后可出现不同程度亮蓝色荧光、染色质凝集、核固缩、核碎裂、凋亡小体等凋亡形态，进一步证实VALD-3可诱导HT-29细胞发生凋亡。

研究表明，细胞DNA 受到不可修复损伤时，可启动凋亡并激活凋亡相关基因的转录，caspase家族、Bcl-2 家族、癌基因及抑癌基因等多种基因均可调节和控制细胞凋亡［18］。Bcl-2 定位于线粒体外膜，主要通过调节线粒体的完整性起到调节作用，具有拮抗促凋亡蛋白的功能，而Bax 是一种水溶性促进凋亡的蛋白，即可与线粒体相互作用，促进细胞色素c的释放，并激活促凋亡因子caspases［19-20］。Caspase家族由15 个成员组成，其中caspase-8、caspase-3 在哺乳动物体内调节细胞凋亡方面发挥着重要作用［21］。Caspase 蛋白酶家族分为两类：一类是启动子，另一类是执行者。启动子（如caspase-8和caspase-9）在信号刺激后通过自身剪接被激活，导致caspase 级联反应；同时，caspase-8 可激活caspase-3、caspase-6 和caspase-7 的级联反应，而caspase-3 是典型的细胞凋亡执行者，一旦caspase-8 或caspase-9 被激活，caspase-3 会裂解许多功能性关键蛋白，导致细胞凋亡［22］；caspase-3 也可通过外源性（死亡配体）和内源性（线粒体）途径在凋亡细胞中被激活［23-25］。本研究Western blot 结果显示，与阴性对照组比较，各浓度VALD-3可显著提高促凋亡蛋白Bax 和caspase-3的表达水平（P＜0.05），且呈递增趋势；caspase-8 只有在20和40 mg／L VALD-3组表达量明显增多（P＜0.05）；40 mg／LVALD-3 组抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达量明显降低（P＜0.05）。这些结果表明，VALD-3 可能是一种较好的抗结直肠癌候选药物。

综上所述，VALD-3可降低结直肠癌细胞的活力和迁移力，诱导细胞凋亡。本研究为临床结直肠癌新型药物的研发及应用提供了新的思路。