UPLC-MS-MS法同时测定颠茄片中2个有效成分的含量*

董丽荣，李应才，孙 赟

（1.昆明市食品药品检验所，云南 昆明 650031；2.云南中医药大学，云南 昆明 650500）

颠茄片主要有效成分为阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱等托烷类生物碱[1-2]。由于含量高低相差悬殊，不适宜同时建立多成分的含量测定方法[3]。近年文献报道，关于颠茄制剂的生物碱类有效成分的测定，均采用高效液相色谱法[4-5]。《中国药典》2020 版一部对颠茄片中的硫酸天仙子胺、东莨菪内酯分别采用2 个不同的高效液相色谱法进行含量测定，方法分析时间长、效率低、操作繁琐，其他峰对主峰干扰大。供试品取样量样量大（100 片），在实际监督抽检工作中，往往样品量难于满足检验需求。本试验建立了采用UPLC-MS/MS 法同时测定颠茄片中硫酸天仙子胺、东莨菪内酯2 种有效成分的定量分析方法。该方法灵敏准确，取样量少，效率高，可为颠茄片质量标准的优化提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AB 4500 质谱仪（SCIEX）；LC-40 超高效液相色谱仪（岛津公司）；AL204（万分之一）电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；MS205DU（十万分之一）电子天平（特勒-托利多仪器上海有限公司）；Arium comfortⅡ超纯水仪（赛多利斯）；SK8210HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 对照品及试剂试药 硫酸天仙子胺（批号110752-500912，纯度96.0%），东莨菪内酯（批号110826-501616，纯度99.6%），均来源于中国食品药品检定研究院；色谱纯甲醇（Fisher 公司），色谱纯甲酸（国药集团化学试剂有限公司）。3 批颠茄片均为天津力生制药股份有限公司生产，批号分别为2101002、2111021、2110019。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液-甲醇，按照表1进行梯度洗脱；流速：0.2 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量4.0 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 质谱条件 采用AB 4500 质谱系统，ESI 源，多反应监测（multiple reactions moniroring，MRM）模式，离子源温度为550 ℃，正负离子扫描，得硫酸天仙子胺、东莨菪内酯的质谱参数见表2，与文献[7]报道基本一致。

表2 各成分质谱参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取硫酸天仙子胺、东莨菪内酯两种对照品各适量，分别置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，得硫酸天仙子胺、东莨菪内酯的质量浓度分别为0.212、0.180 mg·mL-1的单一照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液适量，置同一10 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，得硫酸天仙子胺、东莨菪内酯分别为0.998、1.001 μg·mL-1的混合照品储备液。

2.2.2 供试品溶液 分别取不同批次的颠茄片20片，精密称定，研细，精密称取约0.1 g 置于50 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶液适量，超声提取（频率33 kHz，功率250 W）15 min，放冷，用50%甲醇溶液定容至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1.0 mL 至10 mL 量瓶中，用50%甲醇溶液定容，摇匀，经0.22 μm滤头滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液适量，用50%甲醇稀释成系列浓度混合对照品溶液，其中硫酸天仙子胺质量浓度分别为：193.6、387.2、580.8、774.4、968.0 ng·mL-1，东莨菪内酯质量浓度分别为：1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng·mL-1。取上述系列混合对照溶液，分别按“2.1”项下条件测定，线性回归计算。结果见表3。结果表明，上述2 个成分在各自线性范围内呈良好线性关系。

表3 回归方程与线性范围测定结果

2.3.2 检测限与定量限测定 精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液，逐级稀释后按“2.1”项条件测定，以离子对S/N 为3 考察其检出限，结果硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的检出限分别为的0.25 pg·mL-1和0.10 pg·mL-1；以离子对S/N 为10 考察其定量限，结果硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的定量限分别为0.87 pg·mL-1和0.49 pg·mL-1。

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.3.1”项下项下的混合对照品溶液（硫酸天仙子胺、东莨菪内酯的质量浓度分别为387.19 ng·mL-1、200 ng·mL-1），按“2.1”项条件测定，连续进样6 次，记录各指标成分峰面积并计算其RSD 值。结果硫酸天仙子胺和东莨菪内酯峰面积的RSD 分别为0.91%和1.11%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取批号为2101002 的样品，制备供试品溶液，室温下放置0、2、4、8、12、24 h，按“2.1”项条件测定，记录各指标成分峰面积并计算其RSD值。结果硫酸天仙子胺和东莨菪内酯峰面积的RSD分别为1.25%和1.30%，表明供试品溶液在室温下放置24 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批号样品6 份，制备供试品溶液，按“2.1”项条件分别进样测定，计算各指标成分的含量。结果硫酸天仙子胺、东莨菪内酯含量的RSD 分别为1.41%和0.97%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 准确度试验 分别取已测含量的同一批号（批号为2101002）样品6 份，每份取约0.1 g，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，分别精密加入硫酸天仙子胺和东莨菪内酯对照品溶液适量，按“2.2.2”项下的方法制备成供试品溶液。按“2.1”项下条件测定。结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n=6）

2.3.7 样品含量测定 分别不同批号样品，按“2.2.2”项下的方法制备成供试品溶液。按“2.1”项下条件分别进样测定，计算含量。测定结果见表5。对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的MRM 色谱图见图1。

图1 对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的MRM 色谱对比图

表5 各成分含量测定结果（n=2）

3 讨论与结论

3.1 色谱条件的优化 本实验考察了有机相甲醇和乙腈及梯度洗脱对分离效果的影响。结果用乙腈作为流动相时，硫酸天仙子胺色谱峰出现分叉现象。本实验通过更换色谱柱、调整梯等，依旧无法消除硫酸天仙子胺色谱峰出现分叉现象。故采用甲醇作为流动相，能得到理想的色谱峰形和分离效果，且质谱信号响应较强。

3.2 质谱条件的优化 东莨菪内酯在负离子模式形成的离子比正离子模式形成的离子丰度比更强，碎片离子稳定。综合考虑选择正负离子模式。

3.3 提取溶剂的选择 本文参考2020 版《中国药典》标准，对提取溶剂甲醇和水的比例进行了比较，综合考虑了提取率，基质效应干扰等指标，最终确定甲醇-水（50 ∶50）为提取溶剂。

3.4 供试品溶液杂质峰探讨 图1中显示，供试品溶液中存在东莨菪内酯的杂峰，其离子对信息和东莨菪内酯一致。通过查阅文献可能是属于和东莨菪内酯的同类生物碱。该生物碱是否为活性成分，需要进行质量标准控制，应需进一步研究。

3.5 结论 《中国药典》2020年版一部采用两种HPLC 法测定该药中2 种成分的含量，硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量差异大（硫酸天仙子胺为每片70～120 μg、东莨菪内酯含量为每片不得少于2.2 μg），难于同时进混标测定，方法分离时间为50 min，杂峰干扰明显。UPLC-MS/MS 法定性定量具有灵敏度高、分析速度快、抗干扰强等优势，能大大缩短实验时间，提高效率。本实验建立了UPLC-MS/MS 法同时测定颠茄片中2 种成分的含量。该方法简便快速、灵敏高效、所需样品量小，可为优化提升该制剂质量标准提供参考。