松针色素提取与分析

李 丹 , 赵振伦 , 刘冬然 , 闫胜利 , 刘明武

(沧州旭阳化工有限公司 , 河北 沧州 061113)

松针在我国有22种,其中有10种变种松针,另引栽培16种,其中2种是变种,为木材和树脂生产的主要树种,松针是含有多元酚类的混合物[1-3]。这种多元酚类混合物根据不同的松树物种而变化,所以其作为树种的化学分类标准。松针中富含叶绿素、胡萝卜素、维生素、黄酮类化合物及植物甾醇。叶绿素具有创伤治愈、脱臭、抗过敏、抗溃疡、使肠蠕动功能亢进、抗变异原性、抑癌、降血清胆固醇等药理功能。这些活性物质来自天然植物,安全性高,广泛应用在食品和医药行业。本课题主要研究从松针中提取色素的有效方法。

1 松针的提取工艺

1.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是利用有机溶剂从原料中提取有效成分的方法。选择对目的活性成分溶解度大,对不需要溶出的成分溶解度小的溶剂。溶剂根据相似相溶原理自由扩散,渗透作用通过细胞壁进入细胞内部,溶解可溶性物质。细胞内外产生浓度差,细胞内的浓溶液不断向外扩散,溶剂又不断进入原料组织细胞中,多次往返,直到细胞内外溶液浓度达到动态平衡,将此饱和溶液滤出。常见有机溶剂的亲脂性强弱顺序为:石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇。浸提法(萃取法)是提取色素采用最多的一种方法。将原料分选、水洗、干燥、粉碎,选用溶剂将色素成分提取出来。浸提过程中,应该考虑原料提取温度、提取时间、溶剂用量等影响因素,以提高色素提取率。

1.2 超声波提取法

利用超声波的机械振动和空化效应以及聚束、定向、反射和透射的特性,植物细胞壁被破坏,细胞中的有效成分被完全释放,有效成分进入溶剂并与溶剂充分混合[4]。超声波法具有设备简单,操作方便,提取时间短,可加速植物活性成分在溶剂中的扩散并提高回收率等优点。此外,超声波会产生副作用,如热效应、乳化、扩散、粉碎、化学作用、生物效应和凝聚作用。

本课题主要研究松针色素的提取方法。采用浸提法、超声辅助法进行温度、时间、料液比等提取条件的单因素考察,确定最佳提取条件。对比两种方法的优缺点,利用分光光度计法确定各色素的吸光度,通过计算确定色素含量大小。

2 实验

2.1 实验原料

丙酮,天津市大茂化学试剂厂;95%乙醇,辽宁新兴试剂有限公司;石油醚,天津市大茂化学试剂厂;乙醚,天津市大茂化学试剂厂;氢氧化钠,天津市瑞金特化学品有限公司。以上试剂均为分析纯。

2.2 实验设备

可见分光光度计,723PC,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;数显恒温水浴锅,HH-S2,上海上登实验设备有限公司;三频数控超声波清洗器,KQ-200VDE,昆山市超声仪器有限公司;电子天平,JA300N,上海佑科仪器有限责任公司。

2.3 光度定量分析

对提取液进行定量分析。吸取1 mL滤液用对应萃取液定容到10 mL,等待2 min,以对应溶剂为空白对照测量叶绿素a、叶绿素b分别在663、645 nm波长下的吸光度A。

2.4 色素的计算公式

利用Amon公式:

ca=12.7A663-2.69A645

(1)

cb=22.9A645-4.68A663

(2)

ca+b=(ca+cb)×稀释倍数

(3)

依据提取液中叶绿素的总浓度,可换算出松针中总叶绿素的提取率,%。

(4)

式中:ca,叶绿素a浓度,mg/L;cb,叶绿素b浓度,mg/L;ca+b,叶绿素总浓度,mg/L;V,提取液体积,mL。

2.5 实验步骤

2.5.1松针预处理

新鲜松针用清水洗净,60 ℃条件下干燥1 h,剪成0.3～0.5 cm长备用。

2.5.2有机溶剂的确定

取5个250 mL锥形瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm松针,每个锥形瓶中加入25 mL萃取液。萃取液分别为乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)、乙醇(95%)、丙酮、石油醚、乙醚。锥形瓶放入50 ℃的超声波箱中以频率45 kHz提取色素,提取结束后迅速抽滤,分离得墨绿色溶液,再以同样的方法提取一次,合并两次滤液。提取条件:频率45 kHz,料液比(g∶mL)为1∶5,提取时间为15 min,温度为50 ℃,其他条件相同。吸取1 mL的滤液用对应萃取液定容至10 mL,通过分光光度计测得波长663、645 nm处对应的吸光度值。根据公式(1)、(2)、(3)计算提取率。结果如图1所示。

图1 提取叶绿素溶剂种类的考察结果

由图1可以直观看出,乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)对叶绿素a+b的提取率较高。石油醚对叶绿素的提取率最低。选择混合溶液(乙醇∶丙酮体积比为1∶1)作为此课题提取剂。

2.5.3浸提法

2.5.3.1最佳提取温度的确定

取5个100 mL圆底烧瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针,25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。5个圆底烧瓶分别放入45、50、55、60、65 ℃的水浴锅中回流提取3 h,提取结束后迅速抽滤,收集滤液。提取时间3 h,料液比为1∶5,其他条件相同。测量吸光度方法同上,通过计算提取率确定最佳的提取温度。结果如图2所示。

图2 浸提温度对叶绿素提取率的影响

由图2可知,叶绿素a、叶绿素a+b的提取率在60 ℃条件下最大,叶绿素b的提取率在65 ℃条件下最大。叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b提取率最高分别为0.059 9%、0.030 5%、0.086 3%。松针中叶绿素a的含量远大于叶绿素b,最佳浸提温度为60 ℃。

2.5.3.2最佳提取时间的确定

取5个100 mL圆底烧瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针,25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。将5个圆底烧瓶放入实验(1)中确定的最佳温度60 ℃的水浴锅中分别回流2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h提取色素,迅速抽滤,分离得墨绿色溶液,收集滤液。温度为60 ℃,料液比为1∶5,其他条件相同。测量吸光度方法同上,通过计算提取率确定最佳的时间。结果如图3所示。

图3 浸提提取时间对叶绿素提取率的影响

由图3可以看出,松针在提取3.5 h条件下,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b提取率最高,提取率分别为0.072 1%、0.033 5%、0.105 6%。

2.5.3.3最佳提取料液比的确定

取5个100 mL圆底烧瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针,按松针质量与溶剂体积比(g∶mL)分别为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8,加入乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。将5个圆底烧瓶放入60 ℃水浴锅中回流3.5 h提取色素,回流时间结束后迅速抽滤,分离得墨绿色溶液,收集滤液。温度为60 ℃,时间为3.5 h,其他条件相同。测量吸光度方法同上,通过计算提取率确定最佳的料液比。结果如图4所示。

图4 浸提料液比对叶绿素提取率的影响

由图4可知,松针在提取料液比1∶7条件下,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b提取率最高。提取率分别为0.077 3%、0.035 3%、0.112 6%。综上所述,浸提法提取叶绿素的最佳提取条件:温度为60 ℃、时间为3.5 h、料液比为1∶7。

2.5.4超声辅助法

2.5.4.1最佳提取频率的确定

取3个250 mL锥形瓶中,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针,25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。将3个锥形瓶放入为50 ℃水中,分别以频率45、80、100 kHz超声15 min进行提取,料液比为1∶5,温度为50 ℃,时间为15 min,其他条件相同。提取结束后迅速抽滤,分离得墨绿色溶液,再以同样的方法提取一次,合并两次滤液。测量吸光度方法同上,通过计算确定最佳的频率。结果如图5所示。

图5 提取频率对叶绿素提取率的影响

由图5可以看出,松针在45 kHz条件下,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b提取率最高。最高提取率分别为0.038 9%、0.076 2%、0.115 1%。

2.5.4.2最佳料液比的确定

取5个250 mL锥形瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针,按松针质量与溶剂体积比(g∶mL)分别为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8,加入乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。将5个锥形瓶放入50 ℃水中,以45 kHz频率超声15 min进行提取。频率为45 kHz,温度为50 ℃,时间为15 min,其他条件相同。提取结束后迅速抽滤,再以同样的方法提取一次,合并两次滤液。测量吸光度方法同上,通过计算提取率确定最佳提取的料液比。结果如图6所示。

图6 超声辅助法料液比对叶绿素提取率的影响

由图6可以看出,松针在提取料液比1∶5条件下,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b提取率最高。提取率分别为0.076 5%、0.045 1%、0.121 6%。

2.5.4.3最佳提取温度的确定

取5个250 mL锥形瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针、25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。5个锥形瓶分别放入20、30、40、50、60、70 ℃进行提取。频率为45 kHz,料液比为1∶5,时间为15 min,其他条件相同。提取结束后迅速抽滤,再以同样的方法提取一次,合并两次滤液。测量吸光度方法同上,通过计算提取率确定最佳提取的温度。结果如图7所示。

图7 提取温度对叶绿素提取率的影响

由图7可以看出,松针在提取温度60 ℃条件下,叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b提取率最高。提取率分别为0.065 1%、0.032 1%、0.097 2%。

2.5.4.4最佳提取时间的确定

频率为45 kHz,料液比为1∶5,温度为60 ℃,其他条件相同。取5个250 mL锥形瓶,分别加入5 g 0.3～0.5 cm长松针、25 mL乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)。放入水温为60 ℃,以频率45 kHz分别超声9、11、13、15、17 min进行提取。提取结束后迅速抽滤,再以同样的方法提取一次,合并两次滤液。测量吸光度方法同上,通过计算提取率确定最佳提取的时间。结果如图8所示。

图8 提取时间对松针中叶绿素提取率的影响

由图8可知,松针在提取时间15 min条件下,叶绿素a、叶绿素a+b和叶绿素b的提取率最高。提取率分别为0.087 9%、0.049 9%、0.137 8%。

2.6 浸提和超声辅助条件实验结果的比较

浸提法与超声辅助法提取叶绿素的比较如表1所示。

表1 浸提与超声辅助的比较

由表1可知,超声波提取法比浸提法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的提取率均高。超声波提取法最高提取率为0.137 8%。超声辅助法所需提取时间短、节省原料。浸提法最佳提取条件:温度60 ℃,时间3.5 h,料液比1∶7;超声辅助法最佳提取条件:频率45 kHz,料液比1∶5,温度60 ℃,时间15 min。

3 结论

①浸提法提取松针叶绿素的最佳提取条件: 乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)作提取剂,温度为60 ℃,料液比为1∶7,时间为3.5 h。在此条件下叶绿素a提取率为0.077 3%,叶绿素b提取率为0.035 3%,叶绿素a+b提取率为0.112 6%。②超声辅助法提取松针叶绿素最佳提取条件:乙醇(95%)丙酮混合溶液(体积比为1∶1)作提取剂,频率为45 kHz,料液比为1∶5,温度为60 ℃,时间为15 min。在此条件下叶绿素a提取率为0.087 9%,叶绿素b提取率为0.049 9%,叶绿素a+b提取率为0.137 8%。③超声波提取法比浸提法对叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的提取率均高。超声波提取法最高提取率为0.137 8%。超声辅助法所需提取时间短、节省原料。