中性粒细胞胞外诱捕网络在分泌性中耳炎中的作用及其研究进展

杨志强,陈小婉,张小兵

(1.兰州大学第一临床医学院,甘肃 兰州 730000;2.兰州大学第一医院 耳鼻咽喉头颈外科,甘肃 兰州 730000)

分泌性中耳炎(otitis media with effusion,OME),又称渗出性中耳炎、卡他性中耳炎和胶耳等,是一类以中耳积液及听力下降为主要特征的疾病。OME的平均发病率约14.7%,美国儿科学会和耳鼻咽喉学会等的数据表明在冬季等季节发病率甚至可达84%。OME的临床表现以听力逐渐下降为主要症状,常无耳痛及耳朵流脓等表现,由于90%的患者年龄小于5岁,常由于未察觉症状且描述不清而延误就诊,病程延长后中耳腔渗液的黏稠度增加,更不易清除。中耳腔持续存在的渗液,会进一步导致黏连性中耳炎、鼓室硬化和胆固醇性肉芽肿等不良后果,造成永久性听力下降,迄今仍无有效治疗方法。OME 患儿平均引起28 dBHL的听力损失,其中20%的患儿听力损失大于35 dBHL,同时OME的好发年龄正是儿童语言形成及发展的关键时期,分泌性中耳炎患儿出现听力下降,将会导致语言发育迟缓,从而影响其交流、阅读和写作能力[1-2]。30%～40%的OME患儿反复复发,5%～10%的患儿病程达1年以上[1-2]。OME的发病主要与咽鼓管功能障碍、感染、免疫相关[3-4],但该疾病病理机制尚不明确,其治疗方案也不统一[5]。因此,明确OME的病理机制,提高其诊疗水平,缩短病程,减小OME对儿童言语发育水平及交流能力的不利影响,对于防聋治聋工作有着重要的意义。

1996年,Takei等[6]发现中性粒细胞经佛波酯处理后,中性粒细胞核染色质从破裂的核被膜和细胞膜中释放而显示出形态变化,该变化被认为是一种独特类型的中性粒细胞死亡。Brinkmann等[7]对这种变化进行了深入研究,并发现释放的核染色质能够形成中性粒细胞胞外诱捕网络(neutrophil extracellular traps,NETs),此后涉及NETs的研究明显增加。NETs是一种能够对抗毒性因子并杀灭细菌的胞外网状结构,主要由解聚DNA的胞外链以及中性粒细胞颗粒蛋白组成,这些蛋白包括组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、组织蛋白酶G、白细胞蛋白酶3等30多种蛋白和酶组成[7-9]。有研究在OME患者中耳渗液中发现NETs的主要成分如组蛋白、NE等和较高浓度的中性粒细胞激活标志物:MPO和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白等[10-12],提示OME的炎性反应以NETs为主。

近年来研究发现,NETs虽可以捕杀细菌、真菌、病毒和寄生虫,并防止细菌和真菌播散并对抗严重感染,但NETs的过度形成会导致炎症的恶化、自身免疫性疾病的发生、癌症和血栓的形成等[13-16]。其中NETs清除耳部病原体的能力可能有助于在中耳积液中建立稳定的生物膜群落,加之胞外DNA形成的网状结构骨架,可能会阻碍中耳积液和相关细菌的清除,最终导致慢性OME的发展[17-18]。本综述将讨论NETs的形成及其在OME中作用的研究进展,强调NETs在OME中的双向作用,为OME的病理机制提供新思路。

1 NETs的形成

NETs主要包括溶解性NETs和非溶解性NETs。中性粒细胞经各种刺激诱导活化后,会引起细胞核DNA和/或线粒体DNA向胞外释放[19-20],最终形成NETs的主体结构。

溶解性NETs的形成被认为是一种特殊类型的中性粒细胞程序性死亡,属于固有免疫[14,21]。由于各种刺激,中性粒细胞内依赖还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[22-23]。ROS联合MPO并调节其表达[24-25],以促进NE释放并转移到细胞核内[22,24]。细胞核内的NE促进组蛋白的瓜氨酸化[26],导致染色质解离以及核DNA的释放,最终导致核DNA的胞外释放及NETs的形成[22,24,27]。此外,线粒体相关的ROS在某些刺激下也可诱导溶解性NETs的形成[28-29]。

非溶解性NETs的形成维持了中性粒细胞质膜的完整性,保证了中性粒细胞的存活及功能的完整性[30-31]。研究表明,非溶解性NETs依赖Toll样受体和补体蛋白的参与[20,32]。其中粒细胞-巨噬细胞刺激因子能够刺激中性粒细胞线粒体DNA释放形成NETs,并且这类NETs的形成与ROS密切相关[20]。而金黄色葡萄球菌可以诱导中性粒细胞核DNA通过核膜起泡和囊泡输出的形式形成NETs,这与ROS无明显相关性[19]。然而,目前对非溶解性NETs的研究较少,这需要更多、更深入的研究来拓宽这一领域。

2 NETs在OME中的作用

中性粒细胞是炎症反应的主要效应细胞之一,在炎症初期起到了至关重要的防御作用。NETs作为中性粒细胞功能作用的新机制,依靠其独有的三维网状结构,对细菌、真菌、病毒以及寄生虫等病原微生物的免疫作用提供了结构基础,并在心血管疾病、自身免疫性疾病、系统性红斑狼疮和哮喘等疾病中发挥着重要作用[14,33]。另一方面,NETs独特的网状结构也阻碍了病原体的清除,促使疾病转化为慢性病状态[17-18]。大量研究证明,NETs在OME患者的中耳积液中广泛存在,并且发挥着双向作用。

2.1 OME中的NETs

OME患者或者动物模型中耳黏膜或中耳积液中存在NETs,其主要成分以及特有的网状结构提示OME炎性反应中NETs起到了重要作用。OME患者中耳积液广泛存在NETs结构[10,12,17,34]。流感嗜血杆菌[18]及其裂解物[35]、肺炎双球菌[36]能够建立OME动物模型,并且在诱导的动物模型中耳黏膜及中耳积液中发现了NETs主要蛋白成分组蛋白、NE、MPO以及广泛的胞外DNA网状缠绕,说明NETs参与OME的炎性反应。除了建立动物模型,有研究还进行了细胞实验验证,发现流感嗜血杆菌裂解物[35]、肺炎双球菌[36]和牛分支杆菌[37]能够诱导中性粒细胞形成独特的网格结构,并检测到NETs相关蛋白,这与佛波酯(一种广泛激活NETs形成的刺激物[36])诱导的形成NETs一致。

2.2 OME中NETs相关蛋白及信号通路

NE、MPO、组蛋白在内的30余种蛋白参与构成NETs的形成[7-9]。而在OME中,研究表明,组蛋白、乳铁蛋白酶、NE、MPO、黏蛋白5B(mucin 5B,MUC5B)和MUC5AC等蛋白与NETs的形成密切相关[10,17-18,34,36,38]。其中MUC5B、MUC5AC作为气道分泌蛋白,主要由气道杯状细胞和黏膜下腺体合成,形成上呼吸道的黏液,对黏液的黏弹性起决定作用,进一步影响黏液纤毛清除的功能,并且能够在中耳黏膜中分泌[35,39- 40]。已有研究发现,OME患者的中耳渗液中存在大量的黏蛋白MUC5AC和MUC5B[35],以MUC5B为主[12,41]。病原体的刺激能够激活NF-κB通路,促进趋化因子CxCl2表达,从而间接调控黏蛋白基因的表达[35]。而MUC5B的表达与OME患者听力损失明显相关[41]。在OME患者中耳积液中,MUC5B与胞外DNA组成了网状结构[12],此外MUC5B能够在体外强力诱导NETs的形成[34],这提示MUC5B与NETs的形成具有明显相关性。而白介素-8能够趋化并活化中性粒细胞,在中耳积液中的细胞因子具有极高的丰度[12],但其诱导NETs形成的能力较MUC5B弱[34]。也有研究分析了不同病程组OME患者细胞因子的表达量,发现3个月以上OME儿童中耳积液白介素-8的平均浓度是3个月以下OME患者的10.9倍,这说明白介素-8可能促进了OME转化为慢性病状态[42]。

自噬和ROS的形成对OME相关NETs的形成是不可或缺的,Dong等[36]使用自噬抑制剂和ROS抑制剂分别处理了OME动物和细胞模型,发现NETs减少,并且ROS抑制剂能够逆转自噬的激活。此外,缺乏Toll样受体4的中性粒细胞相对于正常中性粒细胞ROS表达量降低、自噬活性下降及NETs减少,表明在急性OME过程中,NETs是中性粒细胞对抗肺炎双球菌的重要抗菌物质,其中Toll样受体4通过调控自噬激活和ROS的产生参与调节了NETs的形成[36]。抗体一般由B淋巴细胞分泌,并与抗原结合形成抗原-抗体复合物而被机体清除。Short等[43]检测了正常小鼠、缺乏B细胞抗体小鼠和缺乏聚合性免疫球蛋白受体(导致血清游离IgA、IgG增多)小鼠的OME模型中NETs的表达,以及小鼠中耳细菌的滴度,发现抗体促进了NETs的形成,并导致了细菌在中耳的生长,这可能是OME慢性持续的原因之一。

2.3 NETs参与OME细菌生物膜的形成

研究发现,NETs对细菌生物膜的形成具有显著作用,这会促使疾病转化为慢性病状态。在OME的龙猫模型中, NETs存在于流感嗜血杆菌为主的细菌生物膜中,由于流感嗜血杆菌表面的寡聚糖会抵抗NETs对细菌的清除,NETs特有的网状结构反而有助于生物膜的形成,并最终导致了细菌在体内的持久性[18]。Tornton等[17]的研究评估了36份中耳积液样本,发现33份样本存在广泛由NE与胞外DNA共同缠绕形成的NETs,并且NETs中DNA和细菌均与凝集素相联系,而凝集素与生物膜基质中的糖蛋白结合,提示DNA参与构成了中耳积液中的多菌生物膜,NETs清除耳部病原体的能力可能有助于在中耳积液中建立稳定的生物膜群落。在急性中耳炎的动物颞骨和急性起病和复发中耳炎捐赠者的颞骨中,细菌被包裹在纤维蛋白网络的NETs中,以遏制和消除细菌,但它也可能保护这些微生物不被炎症细胞和抗生素清除,从而提供细菌聚集和生物被膜生长的环境,并增加再次感染和疾病慢性化的风险[10]。

2.4 OME中NETs的降解

NETs由胞外DNA作为网状结构骨架,上面有各种颗粒蛋白镶嵌、缠绕和包绕而形成的三维结构[7]。DNA作为结构主体的破坏能够促进NETs的降解,从而促进炎症前期病原体对NETs清除的抵抗[37, 44]或是改善慢性炎症中病原体在中耳的清除[17, 43]。牛分枝杆菌能诱导中性粒细胞形成NETs,与此同时,其分泌的核酸酶MnuA能够迅速酶解NETs的胞外DNA链,引起NETs的降解,并抵抗NETs对牛分枝杆菌的清除[36-37]。DNA酶干预肺炎双球菌导致的OME小鼠模型后,小鼠中耳细菌滴度明显下降[43]。而在DNA酶处理后的中耳积液中,NETs的胞外DNA结构及细菌生物膜基质的降解,导致细菌暴露于机体的免疫系统并被清除[17]。因此,局部使用DNA酶结合抗生素,不失为慢性及复发性OME患者的一种新的治疗方案。

3 总结与展望

OME是常见引起听力下降的疾病,感染在其疾病进程中发挥着重要作用。目前NETs在OME中的研究较少,但已经逐渐成为国内外研究的重点。一方面,中性粒细胞释放的NETs能够清除病原体,对抗感染;另外一方面NETs独特的网状结构可能保护病原体对抗免疫系统和抗生素的清除,并且有些病原体能生成对抗NETs的分泌物,这进一步导致了疾病的迁延不愈。

NETs参与了多种疾病过程,作为新的治疗靶点,NETs抑制剂对疾病的治疗已经取得了一定的进展:当使用DNA酶处理细胞后,NETs的网状结构出现降解; DNA酶已经被批准用于囊性纤维化和脓胸的治疗[45];中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠通过减少NETs的合成,具有保护上皮细胞的作用,被用于肺损伤等疾病的治疗[46]。在OME动物模型身上,给予DNA酶鼓室注射后,观察到了鼓室积液减少[17]。目前,关于NETs对抗并清除中耳炎病原体的作用机制仍有很大的研究空间。因此,如果能够明确感染和NETs在OME中的病理机制,平衡NETs的双向作用,将为OME的治疗提供新的方向,尤其是对病程较长、渗液黏稠的患者具有更重要的意义。