枸杞油果的活性成分及抗氧化性研究

唐新 孙少忆 周泽江 刘军 郑安然 刘敦华

摘要：该研究以枸杞油果（BL）为研究对象，通过对枸杞水提物活性成分和体外抗氧化性的研究，对BL的营养成分和抗氧化性进行评估。结果表明，水提取检测出BL中5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量为28.451 μg/g，常见添加量远低于每日摄入最高限量；与正常枸杞（特级果，SL）相比，BL多糖含量为83.952 mg/g，低于SL，但差异不显著（P＞0.05）；SL酚、黄酮含量BL显著高于SL，分别为27.003 mg GAE/g和0.002 mg RE/g；枸杞抗氧化性在10 mg/mL范围内随浓度升高而提升，且BL的羟基自由基、DPPH自由基、ABTS+自由基清除率的半抑制浓度（IC 50）分别为2.720，1.546，2.461 mg/mL，均低于SL，所以BL水提物的抗氧化活性优于SL。通过傅里叶变换红外光谱测定相关基团，以及固相微萃取-气质联用技术测定挥发性成分的种类和含量，发现相关报道中除了BL水提物较高的酚类和黄酮类化合物含量外，BL中含有的部分美拉德反应产物对枸杞水提物的抗氧化性也有一定程度的贡献。综上，BL具有潜在的利用价值。

关键词：枸杞油果；水提物；活性成分；抗氧化性

中图分类号：TS201.2      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2023）07-0049-07

Abstract： In this study， with browned Lycium barbarum （BL） as the research object， through the study on the active components and in vitro antioxidant activity s of aqueous extract of Lycium barbarum， the nutrients and antioxidant activity of BL are evaluated. The results show that the 5-HMF content of BL detected by water extraction is 28.451 μg/g， and the common addition amount is much lower than the maximum daily intake limit.Compared with standard Lycium barbarum （superfine fruit， SL）， the polysaccharide content of BL is 83.952 mg/g， lower than that of SL， but the difference is not significant （P＞0.05）. The content of phenols and flavonoids of BL is significantly higher than that of SL， which is 27.003 mg GAE/g and 0.002 mg RE/g respectively. The antioxidant activity of Lycium barbarum increase with the increase of concentration within the range of 10 mg/mL， and the semi-inhibitory concentrations （IC 50） of hydroxyl radical scavenging rate， DPPH radical scavenging rate， and ABTS+ radical scavenging rate of BL are 2.720， 1.546， 2.461 mg/mL， which are lower than  those of SL. Therefore， the antioxidant activity of BL aqueous extract is better than that of SL. Through the determination of related groups by Fourier transform infrared spectroscopy， and the determination of the types and content of volatile components by solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry， it is found that in addition to the high content of phenols and flavonoids in BL water extract， some Maillard reaction products contained in BL also contribute to the antioxidant activity of Lycium barbarum aqueous extract to a certain extent. In conclusion， BL has potential utilization value.

Key words： browned Lycium barbarum; aqueous extract; active component; antioxidant activity

枸杞（Lycium barbarum L.）是一種茄科枸杞属植物，在我国多生长于西北地区，并作为一种经济林果在宁夏、新疆、青海、甘肃、内蒙古地区广泛种植[1]。枸杞果实中活性成分种类丰富，因此具有很高的有益健康的潜力，也是我国一种传统中草药，已有超过2 000年的食用历史[2-3]。枸杞鲜果过熟或在雨后采摘，或在烘干、晾晒、采摘过程中造成果实机械损伤，水分挥发过程中果实内容物与空气接触，发生褐变、氧化，而出现颜色发黑、发褐的情况，就会产生“油果”[4]。枸杞色泽的变化是枸杞中的活性物质参与非酶褐变导致的，因此BL与一般的枸杞干果在多糖含量、酚类物质含量上可能存在差异[5-6]。

BL通常被作为下等货或废弃物，因为较差的品相而严重影响商业价值。但BL仍同SL一样，含有多种营养成分。在枸杞水提物中具有多種水溶性有效成分，可被用于总体评估枸杞的生物活性[7]。枸杞在变成BL的过程中最直观的变化就是其颜色发生变化，由最初的鲜红色逐渐变暗，变成暗红色乃至黑色。5-HMF是一种可在食品热加工过程中产生的糠醛化合物，可以在美拉德反应和焦糖化作用下由糖形成[8-9]。基于此，推测枸杞中可能存在这一物质。张静静等[10]的研究中发现枸杞能有效延长果蝇的寿命，且枸杞褐变成黑枸杞，即BL效果更显著，因此BL可能是良好的天然抗氧化剂来源。

本研究以SL为对照，通过研究水提取法评估枸杞多糖、多酚、黄酮在BL中的含量，并探究其体外抗氧化活性，对BL和SL中有效成分和抗氧化性差异做出简单阐述，为揭示BL的潜在利用价值和提高枸杞的综合利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

制干的枸杞油果（BL）与特级果（SL，280粒/50 g）均采用同年份宁杞1号。

1.2 试剂

没食子酸、芦丁、DPPH、ABTS：苏州格锐思生物科技有限公司；5-HMF：北京北实纵横科技发展有限公司；福林酚：上海瑞永生物科技有限公司；维生素C：大连美仑生物技术有限公司；葡萄糖、亚硝酸钠、苯酚、水杨酸、过硫酸钾：甘肃兰州双双化学试剂公司；硫酸：天津市光复精细化工研究所；硝酸铝：上海广诺化学科技有限公司；硫酸亚铁：成都市科龙化工试剂厂；过氧化氢：淄博库仑分析仪器有限公司，以上试剂均为分析纯；溴化钾（光谱纯）：北京化工厂；甲醇（色谱纯）：北京汇海科仪科技有限公司。

1.3 仪器与设备

AL 204型电子天平 厦门莱斯德科学仪器有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机 常州隆和仪器制造有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗机 浙江聚能仪器设备有限公司；TDL-5-A型低速台式离心机 上海隆拓仪器设备有限公司；RE-52AA 型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ A型循环水式多用真空泵 西安予辉实验仪器有限公司；JDG-0.2T真空实验型冻干机 上海乔枫实业有限公司；T6型紫外分光光度计 青岛精诚仪器仪表有限公司；Spectrum Two型傅里叶变换红外光谱仪 PerkinElmer公司；7890B-5977A GC-MSD系统气质联用仪 安捷伦科技（中国）有限公司。

1.4 方法

1.4.1 枸杞水提物制备

本实验采用超声辅助浸泡制备枸杞水提物，步骤：枸杞→蒸馏水冲洗→1∶10加入蒸馏水常温浸泡2 h→组织捣碎机捣碎→超声提取2 h→3 000 r/min离心10 min→取上清液抽滤→负压浓缩→冷冻干燥成粉末。

1.4.2 枸杞油果水提物5-HMF含量的测定

采用高效液相色谱法测定BL中5-HMF的含量，色谱条件参考杨丽等[11]的方法参数设置。实验中拟合的回归方程：Y=157 526X－154 067，R2=0.998 754 1。

1.4.3 枸杞油果活性成分含量的测定

1.4.3.1 枸杞多糖的含量测定

取1.0 mL不同浓度的枸杞提取物样品溶液，按照参考文献[12]的方法操作，测量 490 nm 处的吸光度值。

1.4.3.2 枸杞多酚含量的测定

参考文献[12]的方法并稍作修改，吸取1.0 mL不同浓度的枸杞提取物溶液，添加试剂后于 760 nm 波长处测量标准溶液的吸光度。测量结果表示没食子酸当量的多酚含量（mg GAE/g）。

1.4.3.3 枸杞黄酮含量的测定

参考文献[12]的方法，吸取1.0 mL不同浓度枸杞提取物样品溶液，测量505 nm处的吸光度，测量样品结果表示芦丁当量的黄酮含量（mg RE/g）。

1.4.4 枸杞水提物傅里叶变换红外光谱测定

将KBr在干燥后用研钵研磨，分别取等量BL和SL水提物研磨好的KBr以1∶100比例混匀后研磨压片，光谱范围为4 000～400 cm-1，光谱分辨率为4 cm-1。

1.4.5 枸杞油果水提物挥发性成分分析

1.4.5.1 固相微萃取

称取5 g干燥的枸杞提取物样品放入20 mL顶空样品瓶中，加热箱温度设置为60 ℃。使用50/30 μm的DVB/CAR/PDMS 萃取头，提取30 min后注入样品进行测定。GC-MS进样口温度为250 ℃，热分析时长15 min。

1.4.5.2 GC 条件

样品使用DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行分离，初始温度40 ℃保持3 min，升至150 ℃，在4 ℃/min的速度下保持1 min后升至250 ℃，然后速度设为8 ℃/min，保持6 min。

1.4.5.3 MS 条件

采用EI源，离子源温度200 ℃，传输线温度220 ℃，全扫描，扫描范围（m/z）30～550，溶剂延迟时间1.5 min。

1.4.6 枸杞油果抗氧化能力测定

1.4.6.1 羟基自由基清除能力

参考文献[13]的方法并稍作修改，测量样品溶液在510 nm处的吸光度值。

1.4.6.2 DPPH自由基清除能力

参考文献[14]的方法，于517 nm处测定样品溶液的吸光度值。

1.4.6.3 ABTS+自由基清除能力

参考文献[15]的方法，于734 nm处测量样品溶液加入ABTS+溶液的吸光度值。

1.5 统计分析

本实验均设3组对照，实验数据采用SPSS软件进行分析，所有数据均以平均值±标准差（mean±SD）表示，P<0.05表示差異显著，数据处理及绘图使用Origin 2021。

2 结果与分析

2.1 枸杞油果水提物中5-HMF含量

枸杞干果的糖类成分含量丰富，并且含有多种氨基酸，而5-HMF 被认为是这两类化合物在一定温度、湿度等条件下发生的美拉德反应，以及糖类成分自身发生降解反应的产物[16]，因此推测BL中含有一定量的5-HMF。5-HMF不仅是热处理的指标，而且被认为是具有潜在污染特性的食品污染物[17]。

对枸杞水提物进行液相色谱检测，评估BL在食品加工时5-HMF向水溶性体系中的溶出，由液相色谱图（见图1）得出BL提取物中5-HMF含量为28.451 μg/g，可初步证明BL利于食品的安全性，其提取物可作为各功能性食品的原料使用。

由图2可知，BL提取物中多糖含量为83.952 mg/g，低于SL，无显著性差异。在Han等[18]的研究中，烘干可以使龙眼果肉中的多糖和蛋白质偶联。而枸杞中多糖的糖苷键可以在烘干过程中因为加热发生断裂而降解，糖类与氨基酸作为美拉德反应的底物，反应发生导致果实中多糖含降低。BL形成时发生的“走油现象”使枸杞表面发油发黏，多糖类成分外溢，也会在一定程度上导致果实中的多糖含量降低。因其含量差异不显著，所以实验中BL与SL多糖含量的差异可能主要来源于多糖成分的外溢。

枸杞水提物的多酚含量具有显著差异（P<0.05），其中BL水提物中的多酚含量为27.003 mg GAE/g，显著高于SL。在胡云峰等[19]的研究中，枸杞在制干、储藏过程中，多酚类物质会随着时间及温度的变化逐渐积累，其原因是多酚氧化酶的活性降低。

实验中枸杞水提物中的总黄酮含量较低，这可能与黄酮类在水中的溶解度有关，而BL中的总黄酮含量显著高于SL，为0.002 mg RE/g。水溶性总黄酮类化合物的含量会随着枸杞的干制和储存过程进行积累[20]。产生BL的过程可能与枸杞热风制干后期枸杞一样产生褐色的美拉德反应产物，随着枸杞果实干燥或存储时间的延长，黄酮类物质的含量也随之呈现增加趋势。黄酮类是多酚的一种，所以枸杞黄酮类化合物含量差异与多酚类化合物表现一致。

2.3 枸杞水提物傅里叶变换红外光谱测定

枸杞水提物中含有多种活性成分，可通过对水提物傅里叶变换红外光谱的分析，评估BL中不同活性成分的分子结构，在红外光谱中，某些特征吸收峰代表枸杞中的一些成分[21]。枸杞水提物的傅里叶红外吸收光谱图见图3。

BL和SL所含物质的分子结构整体相似，SL整体吸收峰强度高于BL。这些吸收峰分别是多糖、糖苷、氨基酸、蛋白质和糖醇，1 414 cm-1处的吸收峰为C-N伸缩振动，证明蛋白质存在，NH、OH在3 419 cm-1附近有拉伸振动；在2 926 cm-1附近有甲基（CH）、亚甲基（C—H）伸缩振动，归属于烷烃、脂肪酸类；生物碱和不饱和酯在1 631 cm-1附近；在2 025 cm-1处为（CCN）伸缩振动，归属于不饱和亚胺；接近1 076 cm-1属于糖苷和多糖等碳水化合物的C－OH的弯曲振动[22]。因此，在BL与SL提取物中的主要成分可能为多糖类、苷类、糖醇类、氨基酸和蛋白质类、烷烃、脂肪酸类、不饱和亚酮、羧酸、酯类、生物碱类、不饱和酯类、黄酮类、萜类、酯类等。且由图3可知，除糖苷和多糖等碳水化合物外，BL与SL的各特征吸收峰并未发生明显的偏移，说明二者中主要成分官能团并未发生明显的差异。

2.4 枸杞水提物挥发性成分分析

除营养因素外，枸杞风味是决定消费者对枸杞产品接受度的另一个关键属性，水提物中所含物质均为水溶性挥发性物质，因此可通过对枸杞水提物的挥发性成分分析评估多数BL用于功能饮料等产品中时的风味特征。由图4可知，BL水提物中共检测出19种挥发性物质，与BL相比，SL水提物拥有更多的赋予枸杞芳香味的酯类物质和一些烯烃类，酯类也可为枸杞果实提供芳香气味，是枸杞果实风味的重要来源之一；而BL则具有独有的醛类、醇类和杂环类化合物，其中，BL中醇类的种类和含量显著高于SL，但因为它们的香气阈值相对较高，所以它们对BL风味的影响可能有限[23]。

此外，在两种水提物中检测出不同的长链烷烃，这些烷烃本身味觉阈值较高，其中自身对整体风味的影响较小，但Fu等[24]研究关于长链烷烃对玫瑰精油风味释放的结果表明，长链烷烃可以调节相关风味的释放，是风味释放的重要因素；与SL相比，BL中有3种醛类检出，较低浓度的醛类有助于枸杞获得可接受的味道，而较高浓度则会导致异味，还原性的醛类也可提高体外抗氧化性，这些风味物质的存在表明BL在应用于功能性食品的开发时可能赋予食品一些特殊的风味；BL中的2，3-丁二醇含量高于SL，戊醇、1-甲氧基-2-丁醇、2-辛烯-4-醇在SL中未检出；美拉德反应过程中伴随着明显的颜色变化，这是因为反应形成了一种深褐色高分子聚合物，这类物质可以通过一些还原酮类物质及杂环类化合物等中间产物形成，是美拉德产物中主要的抗氧化成分，具有较强的抗氧化性[25]。在BL中检测出两种挥发性杂环类物质，在SL中未检出，这是因为葡萄糖和相应氨基酸反应可以产生相应的风味物质，脱水后的环Adnadori重排产物随着温度的升高会形成共轭产物，这些共轭产物是挥发性杂环类化合物的前体物质。

2.5 枸杞水提物抗氧化能力

不同浓度的BL、SL、水提物与维生素C的抗氧化能力见图5。BL水提物的羟基自由基清除率均在10 mg/mL时达到最大值，且此时BL的羟基自由基清除率显著高于SL，而DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率数值较接近。BL、SL、维生素C的IC 50值分别为2.720，2.989，2.081 mg/mL；BL的DPPH清除率达到95.53%，BL、SL、维生素C的IC 50值分别为1.546，2.462，1.328 mg/mL；BL的ABTS+自由基清除率为99.95%，BL、SL、维生素C的IC 50值分别为2.461，4.561，1.539 mg/mL。由图5可知，随着水提物质量浓度的上升，自由基清除率呈上升趋势，且BL的清除率始终高于SL，两种枸杞水提物的自由基清除率始终低于对照组维生素C；BL的3种自由基清除率IC 50均低于维生素C而高于SL，表明BL水提物具有更好的抗氧化效果。

多酚含量、黄酮含量与枸杞体外抗氧化能力之间存在很高的相关性，类黄酮的促氧化剂或抗氧化特性具有较强的剂量依赖性，由图2可知，BL水提物中的多酚含量与黄酮含量显著高于SL，因此，由图5可知，BL的抗氧化效果优于SL。在Zeng等[26]的研究中，花生粕水解产物的抗氧化活性在发生美拉德反应后增强，利用GC-MS研究并确定其原因是抗氧化剂化合物的比例增加，其中抗氧化剂的来源主要是酚类化合物。此外，随着美拉德反应的发生，自由基清除活性也可能随美拉德反应的进行而增强，这是因为水性葡萄糖/甘氨酸、D-果糖和D-葡萄糖糖化获得的美拉德产物中间产物或最终褐色化合物具有较强的氢供给能力，使得美拉德反应产物可以更有效地与亲水性自由基（如ABTS+）相互作用[27]。Somjai等[28]的研究结果与这一结论相符，在60 ℃的加热系统中干燥的整个龙眼果实经过美拉德反应或非酶促糖基化反应后，其物理化学和抗氧化特性得到显著增强。而在BL形成的过程中，枸杞果实烘干和晾晒过程中，在一定程度上也会发生美拉德反应，因此BL也可能获得了类似的物理化学和抗氧化特性，使自由基清除率升高。此外，Houssem等[29]的研究表明5-HMF具有显著的清除羟基自由基的能力。因此BL中已确定含有5-HMF，作为一种美拉德反应中间产物具有较强的抗氧化性，其存在也可能是其水提物自由基清除能力显著增强的原因之一。

3 结论

本文以BL为原料，通过对比BL水提物与SL中的活性成分含量和抗氧化性的差异，结果表明，二者多糖含量差异较小，BL的多酚含量、黄酮含量显著高于SL；BL中酚类和黄酮类物质含量高于SL，通过傅里叶变换红外光谱和挥发性成分分析，得出其活性成分和风味物质存在差异，且有部分具有抗氧化性的产物检出，包括5-HMF在内的美拉德反应产物的生成，在一定程度上提高了BL的抗氧化能力，而其含量在安全范围内，因此BL提取物可作为功能性食品的原料。在抗氧化实验中，BL水提物的抗氧化活性低于维生素C，优于SL。BL具有良好的抗氧化活性，在质量浓度为10 mg/mL时自由基清除率与维生素C相近；本研究表明了BL的潜在价值，可以被认为是天然抗氧化剂的良好来源，并可能实现未来用作食品功能性补充剂的潜在用途，为减少枸杞资源的浪费、提高枸杞的综合利用提供一定的理论依据。

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