血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与糖尿病性黄斑水肿程度的相关性

庞久彦,寇姣姣,康 平,王冬梅,周 玉

0 引言

糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema,DME)是糖尿病患者最常见的威胁视力的并发症,其能够引起高渗透性视网膜毛细血管产生的细胞外液水平增加,造成黄斑增厚,导致糖尿病视网膜病变和视力丧失[1]。大约25%的2型糖尿病患者在首次诊断后10a内发展为DME[2]。不同严重程度DME治疗方法有所不同[3],因此迫切需要寻找与DME严重程度相关的因子,从而为临床治疗提供针对性意见。微小RNA(miRNA)是高度保守的内源性ncRNAs的短序列(约22个核苷酸长),参与许多重要生物过程(包括细胞生长、分化和凋亡)[4]。miRNA具有很长的半衰期,并且已经发现其在许多生物液体中是稳定的,包括人血清、血浆、尿液、唾液、眼泪、房水和玻璃体液等[5]。miR-377-3p对多种疾病的发展有抑制作用,如后囊混浊[6]、糖尿病肾病[7]等。miR-365-3p与糖尿病视网膜病变相关[8-9]。关于miR-377-3p和miR-365-3p与DME严重程度相关性的研究目前并不多见,因此本研究通过检测不同严重程度DME患者血清及房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平,研究其与DME严重程度的相关性。

1 对象和方法

1.1 对象前瞻性研究。选取2021-02/2022-02三六三医院收治的初诊为DME患者60例60眼(如双眼发病取严重眼入组,若两眼程度一致取右眼)。纳入标准:(1)均诊断为2型糖尿病并伴有黄斑水肿,黄斑水肿符合以下要求:1)距黄斑中心凹500μm内视网膜增厚;2)距黄斑中心凹500μm内硬性渗出伴相邻视网膜增厚;3)距黄斑中心1个视盘直径范围内超过1个视盘大小的视网膜增厚;(2)根据糖尿病视网膜病变和相关黄斑水肿的国际临床分类标准[10]对DME患者进行分组,轻度组24眼:视网膜后极部可见部分厚度增加及硬性渗出,距黄斑中心较远(大于1倍ODD半径圆形区域);中度组21眼:视网膜后极部可见一定程度部分厚度增加,硬性渗出靠近黄斑中心,但未及1/3～1倍ODD环形区域;重度组15眼:视网膜厚度增加明显,渗出累及黄斑中心;(3)临床资料齐全;(4)最佳矫正视力(BCVA)为0.05～0.5;排除标准:(1)既往玻璃体腔注药史、全视网膜光凝史、闭角性青光眼病史;(2)1a内脑梗塞病史、心机梗塞病史;(3)其他因素引起的黄斑水肿,如视网膜静脉阻塞、葡萄膜炎、高血压视网膜病变,脉络膜新生血管,药物及内眼手术等。 另选同期本院收治的未发生DME的2型糖尿病患者60例作为对照组。对照组均诊断为2型糖尿病,无眼底病变,临床资料齐全,排除标准同DME组。本研究符合《赫尔辛基宣言》原则,经医院伦理委员会批准同意[伦理批号:(2021)科研伦审第(045)号]。所有患者及家属均知情同意并签署同意书。

1.2 方法收集所有受试者基本临床资料,包括BMI、吸烟史、饮酒史、高血压、高血脂、糖尿病病程。全自动生化分析仪检测空腹血糖,全自动糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白,酶法测定同型半胱氨酸(Hcy)。

1.2.1 采集血清样本所有受试者采集清晨空腹肘静脉血6mL,以3000r/min的速度离心10min,取上层血清,置于EP管中,-80℃冰箱存储,待检。

1.2.2 采集房水样本使用30号针头于角膜缘(角虹膜缘3.5～4mm处进针)刺入前房,通过透明角膜穿刺术收集DME患者约0.10mL房水。将房水样品收集在无菌EP管中,2h内进行下一步处理,3000r/min离心10min以防止细胞/细胞碎片污染,取离心后上清液于-80℃储存,所有操作均在无菌环境下进行。

1.2.3qRT-PCR法检测miR-377-3p和miR-365-3p表达水平使用RNA提取试剂盒(Aldrich,USA)提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,USA)将提取的RNA合成cDNA。使用cDNA和SYBR green dye(Applied Biosystems,USA)进行qRT-PCR反应分析,反应体系:10μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,0.2μL正向引物,0.2μL反向引物,0.4μL ROX Reference Dye Ⅱ,6.0μL ddH2O;扩增条件:95℃ 90s,95℃ 30s、63℃ 30s、72℃ 30s共循环40次,使用U6作为内参基因,引物序列见表1。各样品重复3次,取平均值,使用2-ΔΔCt方法(Ct为循环阈值)计算目的基因miR-377-3p、miR-365-3p的相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较DME组患者60例其中男35例,女25例,年龄50～70(平均50.72±10.20)岁。对照组患者60例其中男33例,女27例,年龄51～71(平均51.35±11.32)岁,DME组患者糖尿病病程、糖化血红蛋白、空腹血糖、Hcy均显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平比较DME组患者血清中miR-377-3p(0.67±0.18)和miR-365-3p(0.59±0.16)表达水平均低于对照组(1.01±0.21,1.00±0.32),差异均有统计学意义(t=9.522,8.877,均P<0.01)。

2.3 不同严重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平及CMT比较DME组患者房水中miR-377-3p为0.35±0.11,miR-365-3p为0.46±0.13。DME组中轻度组24眼;中度组21眼;重度组15眼。不同严重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平及CMT比较差异均有统计学意义(P<0.01)。重度组患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平显著低于中度组和轻度组,中度组显著低于轻度组,差异均有统计学意义(P<0.05);重度组CMT显著高于中度组和轻度组,中度组显著高于轻度组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 不同严重程度DME患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平及CMT比较

2.4DME组患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与CMT的相关性DME组患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与CMT呈负相关(r=-0.342、-0.374,均P<0.05);房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与CMT呈负相关(r=-0.425、-0.503,均P<0.05)。

2.52型糖尿病患者发生DME的多因素Logistic回归分析以2型糖尿病患者是否发生DME为因变量,单因素分析中有差异的糖尿病病程、糖化血红蛋白、空腹血糖、Hcy及血清中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平为自变量进行多因素Logistic回归分析,结果见表4,糖尿病病程、空腹血糖及Hcy增加是2型糖尿病患者发生DME的危险因素,血清中miR-377-3p和miR-365-3p是2型糖尿病患者发生DME的保护因素(P<0.05)。

表4 多因素Logistic回归分析

3 讨论

DME发生的主要原因是黄斑增厚,其是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)患者视力丧失的最常见原因,随着2型糖尿病的全球流行,其患病率不断增加[11-12]。其病理生理学始于视网膜氧分压降低,表现为由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和视网膜血管自动调节介导的视网膜毛细血管通透性增高和血管内压升高[13]。在本研究中,糖尿病病程及Hcy均是2型糖尿病患者发生DME的危险因素,这与Hsieh等[14]的研究结果类似,这可能是因为糖尿病患者长期高血糖会影响DME的发展,Hcy在DME发生、发展中的机制尚不明确,可能与Hcy参与损伤血管内皮细胞,导致微血管损伤相关[15]。

DME发病机制复杂,可能与长期高血糖及血糖相关的高渗透损伤视网膜微血管相关[14]。糖尿病患者长期高血糖导致内层视网膜灌注减少和内层视网膜氧张力降低、毛细血管承受的血管内压力升高从而损害毛细血管,同时,视网膜氧张力的降低上调VEGF和其他渗透性因子的合成,从而增加了微血管渗漏,细胞外液通过人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的泵送作用重新进入更下游的视网膜血管或穿过脉络膜而被吸收[13]。Huai等[6]发现,沉默miR-377-3p能够逆转姜黄素对晶状体上皮细胞的保护作用,而miR-377-3p的上调能够抑制TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞恶性变化。在本研究中,DME组患者血清中miR-377-3p水平明显低于对照组,与Jiang等[16]的研究具有一致性,提示miR-377-3p与DME的发生有关,分析原因为VEGF是参与调节血管生成和血管通透性的重要因子,在高糖环境下,VEGF过度表达导致RPE细胞增殖,同时促进血管生成和血管通透性[17],从而引起DME,而VEGF是miR-377-3p的靶基因,MTT分析显示miR-377-3p过表达导致RPE细胞增殖显著减少,且miR-377-3p是DME的诊断标志物[16]。进一步比较不同严重程度DME患者miR-377-3p水平并分析发现,miR-377-3p水平随DME患者病情程度增加而降低,提示miR-377-3p与DME患者病情严重程度有关,可能参与DME病情发展。为验证推测,进行了相关性分析,发现miR-377-3p水平与CMT呈负相关,且miR-377-3p是2型糖尿病患者发生DME的保护因素,提示miR-377-3p可能参与2型糖尿病患者DME的发生发展且具有正向调控作用。

许多研究发现miRNA在某些眼部疾病患者中存在差异表达,有证据表明,miRNA在血清、玻璃体等中的表达水平与眼内病理状况有关,针对影响视网膜的糖尿病并发症,已发现一些miRNA在玻璃体和血清样本中表达差异,如miR-145、miR-92a和miR-375,且其有作为生物标志物或视网膜病变治疗资源的潜力[18]。miRNA在调节几个重要的生物学途径和细胞功能中是必不可少的,研究表明,血清miRNA能够作为各种疾病的生物标志物,包括DR、DME[19]。据报道,多种miRNA与糖尿病患者DME有关:通过PCR阵列检测84个miRNA,Cho等[20]发现,与白内障患者相比,DME患者房水中59种miRNA的表达显著下调,Grieco等[19]研究表明,DME患者血浆及房水中miR-365-3p显著下调,miR-365是糖尿病的潜在治疗靶点,它能够作为内分泌信号分子和潜在疾病生物标志物一样发挥作用[20]。在本研究中,DME组血清miR-365-3p水平显著低于对照组,与Grieco等[19]的研究具有一致性,提示miR-365-3p参与了2型糖尿病患者DME的发生过程,进一步比较分析发现,DME患者病情越严重,miR-365-3p水平越低,提示miR-365-3p可能与DME患者的病情进展有关,其可能正向调控DME病情,为验证推测,进行了相关性分析,发现miR-365-3p水平与CMT呈负相关,且miR-365-3p是2型糖尿病患者发生DME的保护因素,验证了我们的推测,提示miR-365-3p可能是2型糖尿病患者发生发展的重要正向调控因子。

综上所述,miR-377-3p、miR-365-3p在DME患者血清中低表达,与DME患者严重程度呈负相关,临床用来评估DME患者病情严重程度可能具有一定价值,或可依据miR-377-3p、miR-365-3p水平在DME患者血清和房水中的动态变化及时进行不同阶段的针对性治疗。但本研究纳入样本量相对较少、地域性较强,并且缺乏动态监测数据,后续将扩大样本纳入范围继续研究。