云南不同地区回心草中多糖的含量测定

李金茹，角星孟，谢言青，谭文红，刘 录

（云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500）

回心草为苔藓类真藓科植物暖地大叶藓Rhodobryum giganteum（Hook.）Par.的 干燥全草[1]，全草入药，是介于藻类和蕨类之间的高等植物类群[2]。根据文献[3-7]记载，此药味淡，性平，具有养心安神、清肝明目的作用，可用于心悸怔忡、神经衰弱等方面的治疗。《云南中草药选》《云南思茅草药选》《云南中药资源名录》《德宏民族药志》等中均有回心草的记载。现代临床药理研究证明，回心草对血液黏度有明显改善作用[8]，具有降血压、降血脂、抗心肌缺血[9-10]及抗动脉粥样硬化[11]等作用。临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛和高血压等疾病。研究表明回心草富含果糖[12]、植物糖蔗糖、果糖1-酮糖[13]、短链低聚果糖-益生元[14]等糖类，而植物多糖具有抗氧化[15]、降血脂、降血糖[16]、抗肿瘤[17]、抗免疫调节[18]等药理活性。目前对回心草的研究主要集中于对其水煎液的化学成分与药理活性研究，对回心草多糖还未进行深入研究，本实验采用紫外可见分光光度法对回心草水煎液中的多糖进行含量测定，为回心草的更深一步研究与开发应用提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 紫外可见分光光度计（批号：2021132902），购于上海元析仪器有限公司；数显恒温水浴锅（批号：HH-S24s），购于郑州长城科工贸有限公司；旋转蒸发仪（批号：EYELAN-1100）东京理化；电子天平（批号：FA2104N），购于上海菁海仪器有限公司；真空冷冻干燥机（批号：FD-1A-50），购于北京博医康实验仪器有限公司；紫砂煎药壶-45U2（潮州市潮安区康雅顺）全自动煎药壶。葡萄糖化学对照品（批号：1122A0223），购于北京索莱宝科技有限公司；浓硫酸（批号：20180410），购于云南杨林工业开发区汕滇药业有限公司；苯酚（批号：20190201），购于天津市大茂化学试剂厂。

药材采集于云南省4 个地区的15 个地方（大理凤羽镇、大理上兰乡、大理洱源、大理马登乡、保山蒲缥镇、保山施甸、保山腾冲、临沧鸡飞镇、临沧勐海、临沧三岔河、德宏蒲川乡、德宏中山镇、德宏轩岗乡、德宏河兴乡、德宏象达镇），由三九药业集团有限公司提供，经云南中医药大学杨竹雅教授鉴定为药材暖地大叶藓（R. giganteum）的干燥全草。

1.2 冻干粉的制备

1.2.1 正交试验设计 按照卫生部、国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》国中医药发〔2009〕3 号文，花草全草类饮片一般煎煮2 次。加水量一般浸过药面2～5 cm 左右。因此本实验通过正交试验设计，以出膏率为指标，考察提取过程中3 个主要因素：煎煮时间、煎煮次数和加水倍数。见表1。

表1 因素水平表

回心草出膏率测定：精密吸取混合煎煮液20 g，置于恒重蒸发皿，在105 ℃的干燥箱干燥3 h，置干燥器中冷却1 h，迅速称重，质量为W2，按下式公式计算出膏率。出膏率=W2×V/20×W1×100%。式中：W1-回心草的质量（g），W2-浓缩液的干浸膏质量（g）；V-提取液总质量（g）。

1.2.2 正交试验方案与结果 从河头乡（批号：S14）中分别称取9 份回心草饮片，每份100 g，先用纯净水浸泡30 min，按照L9（34）表进行正交试验，滤液合并，按出膏率测定项进行称量计算。D 列为空白列。结果见表2 和表3。

表2 正交试验设计表

表3 方差分析表

结论：3 个因素对回心草出膏量影响程度为：煎煮次数＞加水倍数＞煎煮时间；因素A 、因素C 主具有显著意义，因此影响因子大小顺序为C＞A＞B，A2＞A3＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1，最终方案：A2B1C2，煎煮两次，一煎30 min，二煎25 min，第一次加水24倍，第二次22 倍。

1.2.3 回心草冻干粉制备 称取回心草饮片加入饮片量24 倍的水，浸泡30 min，煎煮30 min，用200 目药典筛趁热过滤，滤渣中加饮片量22 倍的水，再煎煮25 min，用200 目药典筛趁热过滤，合并提取滤液，使用200 目筛进行趁热过滤，在旋转蒸发仪上浓缩（温度50 ℃，压力0.08 MPa）至100 mL，经真空冷冻干燥即得，备用。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备 对照品溶液：精密称取葡萄糖标准品10 mg，置于具塞的200 mL 容量瓶中，加纯水至刻度，制成每1 mL 含有0.05 mg 对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液：精密称取“1.2.3”项制备的回心草冻干粉10 mg，置于具塞的200 mL 容量瓶中，加纯水至刻度，定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.2 方法学验证

2.2.1 线性关系的考察 精密量取“2.1”项对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、1 mL，分别置于10 mL 试管中，加纯水补至1 mL，摇匀，即得浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.05 mg/mL 的对照品溶液，分别精密加入6 % 苯酚0.5 mL，浓硫酸2.5 mL，混匀，在490 nm 波长处测定上述溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，标准方程为y=14.29x+0.2097（R2=0.9994）。结果表明葡萄糖浓度在0～0.05 mg/mL 范围内与其吸收呈良好的线性关系。结果见表4 和图1。

图1 葡萄糖对照品标准曲线

表4 线性关系考察结果

2.2.2 精密度 取对照品溶液适量，按“2.2.1”项下的方法，连续测定溶液6 次吸光度值，结果其RSD 为0.300 %（n=6），表明仪器精密度良好，测定结果可信。结果见表5。

表5 回心草水煎液多糖含量测定精密度实验结果

2.2.3 稳定性 精密称取同一供试品溶液，在隔0、2、4、8、12、24 h 分别测定溶液吸光度值，结果其RSD值为0.438 %（n=6），表明供试品在24 h 内稳定性较好。结果见表6。

表6 回心草水煎液多糖含量测定精密度实验结果

2.2.4 重复性 精密称取同一供试品6 份，按“2.2.1”项下分别测吸光度，以考察本法的重现性。结果RSD=0.502 %（n=6），说明重现性较好。结果见表7。

表7 回心草水煎液多糖含量测定重复性实验结果

2.2.5 加样回收率 精密称取等量的供试品溶液6份，分别加入一定量葡萄糖对照品溶液，按上述“2.2.1”项下方法进行测定，结果平均回收率为98.8%，RSD 值为0.706 %（n=6）。结果见表8。

表8 回心草水煎液多糖含量测定加样回收实验结果

2.3 样品含量测定 精密称取15 批供试品，按“2.1”项方法制备成供试品溶液，并按“2.2.1”项方法测定吸光度值，并计算15 批供试品中多糖的含量。结果见表9。

表9 不同地区回心草多糖含量

3 结论

本实验制备多糖的方式为水煎煮法，通过紫外分光光度计法对15 批回心草样品中多糖进行含量测定，多糖含量分别范围在15.75%～65.96%之间。结果表明该多糖含量测定方法具有良好的准确度，精密度和稳定性，实验方法简单易行。实验为今后进一步研究回心草多糖结构及药理试验奠定实验基础。

4 讨论

云南省4 个地区所产回心草多糖含量存在显著差异，其中以临沧鸡飞镇的回心草多糖含量最高，德宏象达镇的回心草多糖含量最低。因采收时间、生长年限、产地环境及处理方式等因素，回心草的多糖含量可能存在一定影响。多糖的含量测定有比色法、滴定法、高效液相色谱法、气相色谱法等多种方法。目前使用的比色法中的苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法这两种方法操作简单，测定速度快[19]，苯酚－硫酸法主要用于多聚糖、甲基化的糖和戊糖等糖类的测定，而蒽酮－硫酸法对所有的碳水化合物几乎都可以测定[20]，回心草中含有果糖、戊糖及多糖，因此苯酚－硫酸法是回心草多糖含量测定的理想方法。回心草传统应用上多为回心草水煎液，具有降血糖、降血脂、抗凝血活性、抗炎等药理作用，民间主要用于治疗心脏病、预防心血管等方面的疾病，而回心草水煎液中主要含有多糖成分，因此推测其功效作用与其多糖有着密切关系。