番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析

蒋 磊，徐世强，徐 凯，丁 菲，江 彤*

番茄黄化曲叶病毒安徽分离物的基因组结构特征及变异分析

蒋 磊1, 2, 3，徐世强1，徐 凯1，丁 菲1，江 彤1, 2, 3*

(1. 安徽农业大学植物保护学院，合肥 230036；2. 作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，合肥 230036;3. 植物病虫害生物学与绿色防控安徽省普通高校重点实验室，合肥 230036)

利用滚环扩增（RCA）技术从安徽淮北番茄温室表现曲叶症状的番茄上获得番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）的2个分离物全基因组。 2个TYLCV DNA-A核苷酸序列全长均为2 781 nts，共编码6个ORF。序列比对结果表明，2个TYLCV安徽分离物DNA-A核苷酸序列同源性为99.7%，与已报道的国内外其他24个TYLCV各分离物同源性高达97.8% ～ 99.9%。系统进化分析显示，TYLCV安徽分离物与来自吉林、沈阳、天津、邯郸和山东的5个TYLCV分离物亲缘关系最近。

滚环扩增；番茄黄化曲叶病毒；序列分析

番茄黄化曲叶病是世界上普遍发生的一种番茄病害[1]，该病是由番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）引起，主要危害番茄、茄子、黄瓜和烟草等经济作物，感病番茄植株通常表现顶部叶片皱缩、黄化、卷曲，严重时植株矮化，生长停止[1-2]。

番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科（）菜豆金色花叶病毒属（）[1]。根据基因组结构的不同，TYLCV可以分为双组分（DNA-A和DNA-B）和单组分（DNA-A）2种类型，其中DNA-A组分约2.8 kb，由病毒链和互补链共同编码，共有6个开放阅读框（opening reading frame, ORFs），能够在寄主细胞核内形成双链DNA复制中间体[3-4]。

20世纪中期，已有关于番茄黄化曲叶病毒病的报道，70年代末引起该病的TLYCV才被正式命名，此后迅速蔓延至非洲、中东、澳洲、美洲的中部和南部以及亚洲的南部等热带和亚热带地区[1]。2006年，TYLCV在我国上海首次报道[5]，随后相继在北京、天津、辽宁、江苏、湖北、四川、新疆等省市和地区检测到该病毒[6-7]。近年来TYLCV已扩散到我国各省市番茄种植区，每年有近20万hm2的番茄受到TYLCV的危害，造成的经济损失高达数十亿元，严重危害我国番茄产业的发展[8-10]。由于番茄种苗的频繁调运，烟粉虱已迅速成为淮北市保护地番茄的主要虫害，烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病发生逐年加重，给淮北市的番茄生产造成严重损失。本研究拟采用滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）获得引起安徽淮北番茄黄化曲叶病的TYLCV分离物全基因组，进一步进行序列分析，了解其结构特征及与其他地区TYLCV间的进化关系，明确安徽番茄上TYLCV的起源，为选育和筛选安徽省番茄TYLCV抗病品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病样来源

从安徽省淮北市相山区采集疑似感染TYLCV的番茄植株，症状表现为叶片褪绿黄化，边缘卷曲，样本保存于﹣80 ℃冰箱备用。

1.2 总DNA提取

利用CTAB法[11]提取2个番茄叶片样本总DNA。

1.3 RCA扩增、RCA-RFLP分析和PCR扩增

利用Templiphi TM Kit（GE Healthcare），按照试剂盒说明书上的步骤以获得病毒全基因组。扩增产物用H I、d III等限制性内切酶（Promega）处理。酶切体系为：RCA产物3mL、内切酶1mL、内切酶缓冲液 5mL，总体系为50mL，在37 ℃条件下酶切3 h。酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离。

设计DNA β特异性引物beta01（5´- GGTACCA CTACGCTACGCAGCAGCC-3´）和beta02（5´- GT ACCTACCCTCCCAGGGGTACAC - 3´）。 PCR反应条件，94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min， 30个循环后，72 ℃延伸5 min。

1.4 序列测定和分析

割胶回收特异性条带，构建到用同样限制性内切酶酶切的pGEM-7zf载体上，委托安徽通用生物有限公司测序。利用软件DNAStar（DNASTAR Inc, Madison, USA）和DNAMAN Version 5.22（Lynnon Biosoft, Quebe, Canada）进行序列分析。多序列比较采用DNAStar Clustal V方法，系统进化树构建采用DNAMAN的邻近相连法（Neighbor-joining）。

2 结果与分析

2.1 用RCA-RFLP分析TYLCV DNA-A

提取2个番茄样本DNA（AH-HB1和AH-HB2）进行RCA扩增，分别得到一条5.4 kb和2.7 kb的片段（图1）。

M：DNA marker；1：AH-HB1；2：AH-HB2。

Figure 1 Agarose gel analysis of RCA products

用H I进一步消化RCA产物，酶切后均得到一条约2.7 kb的特异性片段（图2），克隆并测序，序列长度均为2 781 nts。

M：DNA marker；1：AH-HB1；2：AH-HB2。

Figure 2 Agarose gel analysis of RCA products digested withH I

在NCBI上比对序列发现，这2个片段确为TYLCV的DNA-A组分，二者的序列相似性为99.7%，2个病毒安徽分离物分别命名为TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2，其GenBank登录号分别为FN650807和FN650808。利用DNA β特异性引物对提取的总DNA进行PCR检测，未扩增到TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2的DNAβ基因组片段，说明番茄黄化曲叶病毒安徽分离物不伴随DNA β分子。

序列测定表明，2个TYLCV安徽分离物的DNA-A均具有典型的begomoviruses结构，分别编码6个开放读码框（ORFs），其中病毒链编码AV1（CP）和AV2，互补链编码AC1（Rep）、AC2、AC3和AC4，中间被间隔区（IR）隔开。IR区含有茎环结构和保守的九核苷酸序列TAATATTAC。

2.2 TYLCV-AH-HB1 DNA-A与其他TYLCV分离物DNA-A的相似性分析

比对TYLCV-AH-HB1与GenBank已登录的24个其他地区的TYLCV分离物核苷酸序列性，结果发现，TYLCV-AH-HB1与其他TYLCV分离物DNA-A核苷酸序列相似性为97.8% ～ 99.9%，其中与TYLCV-Shandong（GQ352537）的序列相似性最高，为99.9%。另外，比对TYLCV-AH-HB1与其他TYLCV分离物IR区核苷酸序列相似性以及AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4氨基酸序列相似性发现，IR区核苷酸序列相似性为94.6% ～ 99.4%，AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4氨基酸序列相似性分别为96.1% ～ 100%、98.3% ～ 100%、97.5% ～ 100%、94.8% ～100%、94.0% ～ 100%和95.9% ～ 100%，TYLCV-AH-HB1 AV1、AV2、AC2和AC4均与TYLCV-Shandong相应片段的序列相似性最高，达100%（表1）。

表1 AH-HB1与其他24个TYLCV分离物序列相似性

注:a代表核苷酸序列；b代表氨基酸序列。

2.3 TYLCV-AH-HB1与其他地区TYLCV分离物的系统进化分析

构建TYLCV-AH-HB1与其他地区24个TYLCV分离物的系统进化树，结果发现，进化树共分成2个分支，AH-HB1与来自日本、澳大利亚、墨西哥和中国其他地区的17个分离物聚成一个分支，而来自于西班牙、荷兰、埃及和古巴的4个分离物聚成另外一个分支。AH-HB1与来自于吉林、沈阳、天津、邯郸和山东的5个分离物亲缘关系较近，聚成一个单独的小分支（图3）。

3 讨论与结论

扩增双生病毒基因组一般在病毒基因组的IR区设计一对通用引物PA/PB，先扩增出一条约500 bp的片段，再根据测定的序列设计特异性引物反向扩增剩余的大片段，然后拼接获得理论上的全长基因组。这种方法的缺点是如果一个新的双生病毒序列变异较大，通用引物PA/PB不一定能扩增出小片段，大片段更是无法获得。另外，这种方法无法获得客观存在双生病毒全长基因组，如果要进一步构建病毒的侵染性克隆，需要在某个单酶切位点设计一对背靠背引物进行PCR扩增，获得全长基因组再构建侵染性克隆，方法比较繁琐。

双生病毒的复制先以病毒链DNA为模板合成互补链，形成dsDNA复制中间体，病毒编码的复制酶蛋白（Rep）切割dsDNA后以互补链为模板连续滚环复制出正义链DNA[12]。而滚环扩增（RCA）的原理是建立在滚环复制的基础上，在DNA聚合酶的作用下，这种亲代单链DNA的延伸可以一直进行下去，产生长短不一的亲代DNA多拷贝长链，理论上任何一个酶切位点都可以切割出单拷贝全长基因组。这种方法不需要设计引物，也不需要PCR仪，扩增后用一个合适的限制性内切酶消化，将获得的单拷贝DNA克隆到载体上，无论是测序还是构建侵染性克隆都很方便[13]。

图3 安徽分离物与其他24个TYLCV分离物的系统进化树

Figure 3 Phylogenetic tree of Anhui isolate and 24 isolate of TYLCV

本研究采用RCA扩增及基因克隆方法，获得了侵染安徽淮北番茄的双生病毒2个基因组全序列TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2，大小均为2 781 nts，序列相似性为99.7%，与国际上已报道的TYLCV各分离物序列相似性均在97.8%以上，其中与我国其他地区的TYLCV分离物序列相似性均在98.8%以上。利用PCR在感染TYLCV-AH-HB1和TYLCV-AH-HB2的番茄样本中，均未检测到DNAβ的存在，之前也有一些报道显示TYLCV分离物检测不到卫星分子[14-16]，说明DNA β分子对TYLCV田间分离物致病可能不是必须的。根据目前国际双生病毒分类方案，可确定引起安徽淮北番茄黄化曲叶病的病原是TYLCV安徽分离物。本文首次对侵染安徽省番茄的TYLCV进行分子鉴定和序列分析，明确了TYLCV安徽分离物的分子特征，为构建TYLCV侵染性克隆鉴定番茄品种抗病性奠定了基础，也将为安徽省番茄抗病品种的选育以及番茄黄化曲叶病的防控提供科学依据。

TYLCV可通过烟粉虱以持久性方式传播。随着皖北地区设施农业的快速发展，为烟粉虱提供越来越多的理想越冬场所，TYLCV大面积暴发的可能性也大大增加。系统进化树分析发现，TYLCV-AH-HB1与来自东北和华北地区吉林、沈阳、天津、邯郸和山东各个TYLCV分离物的亲缘关系最近，安徽淮北属于华北地区，山东省是临近的蔬菜种植大省，山东潍坊和寿光是全国主要的番茄种植地区，安徽皖北部分蔬菜种苗来自于山东省，推测传染安徽番茄黄化曲叶病的烟粉虱可能随蔬菜种苗调运从山东传播到安徽。

[1] PRASAD A, SHARMA N, HARI-GOWTHEM G, et al. Tomato yellow leaf curl virus: impact, challenges, and management[J]. Trends Plant Sci, 2020, 25(9): 897-911.

[2] 姜静, 王银磊, 李亚茹, 等. 江苏省及其他地区番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定及序列分析[J]. 江苏农业学报, 2018, 34(1): 238-240.

[3] BASAK J. Tomato yellow leaf curl virus: a serious threat to tomato plants world wide[J]. J Plant Pathol Microbiol, 2016, 7(4): 1000346.

[4] LEKE W N, MIGNOUNA D B, BROWN J K, et al. Begomovirus disease complex: emerging threat to vegetable production systems of West and Central Africa[J]. Agric Food Secur, 2015, 4(1): 1-14.

[5] WU J B, DAI F M, ZHOU X P. First report of tomato yellow leaf curl virus in China[J]. Plant Dis, 2006, 90(10): 1359.

[6] 苗相伟. 番茄黄化曲叶病毒病的研究进展[J]. 中国果菜, 2017, 37(3): 31-35.

[7] 孙胜, 亢秀萍, 邢国明, 等. 番茄黄化曲叶病毒病研究进展[J]. 东北农业大学学报, 2015, 46(5): 102-108.

[8] 张前荣, 李大忠, 朱海生, 等. 番茄黄化曲叶病毒研究进展[J]. 分子植物育种, 2017, 15(9): 3709-3716.

[9] 高敏丽, 张华. 番茄黄化曲叶病毒病的研究进展分析[J]. 粮食科技与经济, 2019, 44(3): 73-74, 93.

[10] 王勃颖, 宗义湘, 董鑫. 河北省番茄产业发展现状及问题分析[J]. 中国蔬菜, 2020(7): 7-12.

[11] 谭小艳, 马耀华, 郝兆祥. 4种改良CTAB法提取石榴成熟叶片DNA的比较研究[J]. 中国南方果树, 2021, 50(3): 122-125.

[12] 杨秋颖, 杨秀玲, 丁波, 等. 双生病毒在生物技术中的应用[J]. 中国科学: 生命科学, 2016, 46(5): 524-534.

[13] 余玲玲, 钱亚娟, 周雪平. 用滚环扩增技术检测双生病毒[J]. 植物病理学报, 2008, 38(6): 570-575.

[14] XIE Y, JIANG T, ZHOU X P. Agroinoculation shows tobacco leaf curl Yunnan virus is a monopartite begomovirus[J]. Eur J Plant Pathol, 2006, 115(4): 369-375.

[15] XU Y P, CAI X Z, ZHOU X P. Tomato leaf curl Guangxi virus is a distinct monopartite begomovirus species[J]. Eur J Plant Pathol, 2007, 118(3): 287-294.

[16] 王浩权, 纠敏, 汪伦记, 等. 侵染河南省番茄的番茄黄化曲叶病毒及伴随卫星DNA分子的基因组特征[J]. 河南农业科学, 2016, 45(10): 71-75, 84.

Genomic structure characteristics and variation analysisof tomato yellow leaf curl virus Anhui isolate

JIANG Lei1, 2, 3, XU Shiqiang1, XU Kai1, DING Fei1, JIANG Tong1, 2, 3

(1. School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036; 2. Anhui Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops, Hefei 230036; 3. Key Laboratory of Biology and Sustainable Management of Plant Diseases and Pests of Anhui Higher Education Institutes, Hefei 230036)

The whole genomes of two isolates of tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) from the tomatos exhibited curved leaf symptom in greenhouse of Huaibei, Anhui Province were obtained by rolling circle amplification (RCA). The two nucleic acid sequences of TYLCV DNA-A were both 2 781 nucleotides (nts) in length, containing six potential ORFs. The results of sequence alignment showed that the nucleic acid sequence homology of the two TYLCV Anhui isolates was 99.7%, and they shared identity of 97.8% - 99.9% with other 24 TYLCV isolates in domestic and foreign. Phylogenetic analysis showed that TYLCV Anhui isolate had the closest relationships with the other five TYLCV isolates from Jilin, Shenyang, Tianjin, Handan and Shandong.

rolling circle amplification; tomato yellow leaf curl virus; phylogenetic analysis

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230625.014

2023-06-27 10:03:22

S432.41

A

1672-352X (2023)03-0446-04

2022-05-03

安徽省重点研究与开发计划项目（202004a06020013），大学生创新创业训练计划项目（dg193404）和安徽省博士后基金项目（2019B360）共同资助。

蒋 磊，讲师。E-mail：jianglei062x@ahau.edu.cn 徐世强，硕士研究生。E-mail：xushiqiang1001@sina.com

通信作者:江 彤，教授。E-mail：jiangtong4650@sina.com

[URL] https://kns.cnki.net/kcms2/detail/34.1162.S.20230625.1458.028.html