猪繁殖与呼吸综合征病毒检测方法的建立

文│张晶（福建省农产品质量安全检验检测中心）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是猪中最严重、传播最迅速的传染病之一。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征的直接病原体。

目前PCR是检测PRRSV病毒标准而有效的诊断方法，具有较高的特异性和敏感性。但因其耗时较长，需要昂贵的设备、有经验的技术人员和专业实验室等限制了其进一步应用，尤其是即时现场检测应用领域。因此，开发一种简单、准确、快速的检测方法至关重要。

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi等提出的一种核酸等温扩增方法，即针对特定靶标的6～8个区段设计的4～6条不同的引物，在恒定温度（60～65℃）下15～60分钟内实现109～1010倍的扩增，结果可通过荧光变化、溶液浑浊情况（扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀为依据观察白色沉淀）、比色法等进行判断，具备高灵敏、高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。LAMP技术是一种快速有效识别病原体感染的即时诊断技术，已广泛应用于人类及动植物细菌、病毒、寄生虫、真菌等病原体检测，尤其在新型冠状病毒SARS-CoV-2的检测中发挥了重要作用。

本研究在RT-LAMP的基础上建立了一种简便、快速、灵敏的PRRSV检测方法。笔者先是设计并筛选出高扩增性能的PRRSVRT-LAMP引物对，同时通过体系优化添加化学试剂，进一步提高反应速率，缩短反应时间。最后对PRRSVRT-LAMP体系（包括荧光法、可视化检测）性能进行评价。

一、材料与方法

1.P R R S V R T-L A M P 引物对设计与合成。我们以P R R S V SRV07菌株的基因组（GenBank No.JX 512910.2）为标准序列，采用BLAST在线网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源序列比对，而后用引物设计网站NEBRLAMP Primer Design Tool（https://lamp.neb.com）进行LAMP引物对设计。同时合成带有PRRSV M基因14460-14810片段（GenBank No. JX512910.2）的PUC57为载体的质粒和RNA假病毒作为阳性参照。引物（表1）、质粒和RNA假病毒均由上海生工生物股份有限公司生产。

表1 PRRSV RT-LAMP引物对序列

2.PRRSV RT-LAMP引物对筛选。PRRSV RT-LAMP引物对筛选采用RT-LAMP实时荧光法。我们通过文献选取了额外4组公开报道的用于PRRSV临床样本检测验证的LAMP引物对（表1），并与本研究所设计的LAMP引物对进行扩增效率比较，用以确定最佳检测效率的引物对。其中，25微升反应体积的PRRSV RT-LAMP荧光法检测体系成分包含1×Bst 4.2 Basic Mix（Cat. No.:A3831-01，HaiGene），0.32 U/微升HotStart Bst 4.2（Cat. No.: A3831-01，HaiGene），1×SYBRTMGreen I（Cat.No.: S7563，ThermoFisher），0.2微米 F3/B3，1.6微米FIP/BIP，0.4微米LF/LB（若有），1微升反应模板（基因组、质粒或RNA假病毒等），剩余用无核酸酶水补足25微升。在荧光PCR仪中65℃反应1小时，每隔1分钟收集一次荧光。注：HotStart Bst 4.2具有DNA/RNA通扩能力，因此，PRRSV RT-LAMP体系不需要额外添加逆转录酶。

3.化学添加剂对PRRSV RTLAMP检测体系性能的影响。甜菜碱（Betaine）不仅可以通过减小二级结构的形成来提高DNA的扩增，还可以通过消除DNA融化/变性时对碱基对的依赖提高扩增特异性，常用于PCR扩增。甘氨酸（Glycine）类似于L-脯氨酸，据文献资料报道，其有助于提高LAMP反应速率，缩短反应时间。因此，我们采用了上述两种化学添加剂研究其对PRRSV RT-LAMP检测体系性能的影响。

4.PRRSV RT-LAMP检测体系灵敏度和特异度考察。

（1）PRRSV RT-LAMP荧光法快速检测体系。PRRSV RT-LAMP荧光法检测体系中额外添加0.5M Glycine，其余反应参数不变。

（2）PRRSV RT-LAMP荧光法快速检测体系灵敏度。PRRSV RNA假病毒经EASY Dilution（for Real Time PCR）（Cat. No.: 9160，Takara）进行稀释，用PRRSV RT-LAMP荧光法快速检测体系进行检测，并以无核酸酶水作为阴性对照。根据有无荧光信号及其信号强弱判定体系最低检测下限。

（3）PRRSV RT-LAMP荧光法快速检测体系特异度。以猪圆环病毒Ⅱ型PCV-2）、非洲猪瘟（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因组作为研究对象，并以PRRSV RNA假病毒为阳性对照，研究PRRSV RTLAMP荧光法快速检测体系特异度。

5.PRRSV RT-LAMP可视化检测。除了荧光检测，PRRSV RTLAMP检测结果还可通过以下两种方法用肉眼判读结果。浑浊法：以扩增产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀为依据观察白色沉淀；比色法：反应体系中加入染料观察扩增结果是否产生相应颜色来判定是否有目的产物扩增。对比荧光法快速检测体系，浑浊法体系不加入1×SYBRTMGreen I，反应时间为35分钟，其他条件不变；而比色法体系则是1×WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix（M1800，NEB），0.2微米F3/B3，1.6微米FIP/BIP，0.4微米LF/LB，1微升反应模板，剩余用无核酸酶水补足25微升。65℃反应1小时，每隔1分钟收集一次荧光。

二、结果与讨论

1.PRRSV RT-LAMP引物对筛选。采用相同浓度的PRRSV质粒（105copies/微升）作为体系反应模板，研究上述5组引物对的扩增效率。结果发现，5组引物对阴性对照均没有信号，而阳性质粒在不同引物对体系中呈现不同的Ct值。Ct值越小，即阳性信号产生所需时间越短，体系反应效率越高。其中，引物对1，即本研究所设计的引物对（1-F3/1-B3，1-FIP/1-BIP，1-LF/1-LB），阳性Ct值最小，反应速度最快，扩增效率最高。选择该引物对做后续分析。

2.化学添加剂对PRRSV RTLAMP体系反应速率影响。结果发现，甜菜碱降低了PRRSV RT-LAMP体系扩增效率，与马翠萍等的研究结果一致。而0.5 M甘氨酸用量显著提高了检测体系的反应速率，使反应时间缩短了一半（106拷贝数阳性质粒：30分钟→15分钟以内；103拷贝数阳性质粒：60分钟→30分钟以内）。而添加甜菜碱减弱了体系的扩增效率可能是由于本研究采用的是商业化的LAMP试剂盒（HaiGene），体系buffer已达到较优水平，甜菜碱具有弱化氢键的能力，反而不利于LAMP反应的进行。

3.PRRSV RT-LAMP快速检测体系敏感性和特异性分析。利用快速体系（荧光法）检测一系列浓度梯度（107→102拷贝数）的PRRSV RNA假病毒，结果发现，体系在35分钟左右实现500拷贝数/反应的最低检测下限。同时，与PCV-2、CSFV、PEDV等猪蓝耳病相似症状的病毒无交叉反应，体系特异度良好。

4.PRRSV RT-LAMP体系可视化检测。为了进一步提高PRRSV RT-LAMP体系在各种场合的灵活应用，尤其是资源有限的场所，摆脱对复杂、昂贵光学仪器的依赖，我们比较了两种肉眼判读结果的方法。采用浑浊法判读结果，快速检测体系在35分钟左右实现500拷贝数/反应的最低检测下限。采用比色法判读结果，加入甘氨酸的检测体系均不变色（仍保持黄色），不加入甘氨酸的检测体系最低检测下限为103拷贝数/反应，与PCV-2、CSFV、PEDV等猪蓝耳病相似症状的病毒无交叉反应，体系特异度良好。

三、结语