柴胡皂苷B通过Nrf2/ARE信号缓解Caco-2细胞氧化损伤

杨慧 黄丽丽

[摘要] 目的 探討柴胡皂苷B（saikosaponin B，SSB）对棕榈酸（palmitic acid，PA）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）联合诱导的人结直肠腺癌细胞（Caco-2）屏障损伤的保护作用及潜在机制。方法 利用Caco-2细胞构建肠道屏障模型，采用随机数字表法将细胞分为对照组（CON组，n=6），模型组（PA+LPS组，n=6）和柴胡皂苷B干预组（PA+LPS+SSB组，n=6），通过测量跨膜电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）值和紧密连接蛋白的表达水平，评价SSB对Caco-2细胞屏障损伤的保护作用。通过检测活性氧（reactive oxygen species，ROS）和脂质过氧化物含量评估细胞氧化压力。通过定量聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测SSB对Nrf2/ARE信号通路相关基因及蛋白的表达水平的影响。通过敲降Nrf2验证SSB改善细胞屏障功能是否通过Nrf2/ARE途径。结果 PA+LPS+SSB组Caco-2细胞的TEER值、ZO-1和Occludin-1的蛋白水平显著高于PA+LPS组（P<0.05）。PA+LPS组细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）、蛋白羰基含量（protein carbonyl content，PCC）和ROS含量均显著高于对照组（P<0.05），PA+LPS+SSB组的4-HNE、MDA、ROS含量和PCC均显著低于PA+LPS组（P<0.05）。PA+LPS+SSB组细胞内Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平、Nqo1和Ho-1的mRNA水平、过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活性均显著高于PA+LPS组（P<0.05）。PA+LPS+SSBsiNrf2组细胞中ZO-1和Occludin-1的蛋白水平和转录水平均显著低于PA+LPS+SSB组（P<0.05），ROS、4-HNE、MDA含量和PCC均显著高于PA+LPS+SSB组（P<0.05）。结论 SSB通过激活Nrf2/ARE信号通路增加了肠上皮细胞的抗氧化能力，抑制了PA和LPS引起的Caco-2细胞氧化应激和屏障损伤，对肠上皮细胞具有良好保护作用。

[关键词] 柴胡皂苷B；屏障损伤；Nrf2/ARE；氧化应激

[中图分类号] R285.5      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.20.015

Saikosaponin B alleviates oxidative stress and barrier damage in Caco-2 cells through activation of Nrf2/ARE signaling

YANG Hui， HUANG Lili

Department of Pharmacy， Ningbo Medical Center Lihuili Hospital， Ningbo 315040， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect and therapeutic mechanism of saikosaponin B （SSB） on Caco-2 cell barrier damage induced by the combination of palmitic acid （PA） and lipopolysaccharide （LPS）. Methods A monolayer barrier model of Caco-2 cells was constructed in vitro and the cells were divided into control （CON， n=6） group， model （PA+LPS， n=6） group and saikosaponin B （PA+LPS+SSB， n=6） group according to the random number table method. The regulatory effects of SSB on barrier injury in Caco-2 cells were observed by measuring transepithelial electrical resistance （TEER） values， gene and protein levels of tight junction molecules. Cellular oxidative stress was assessed by reactive oxygen species （ROS） and lipid peroxide levels. The effect of SSB on the expression levels of genes and proteins related to the Nrf2/ARE signaling pathway was examined by quantitative PCR and Western blot. Cell transfection was performed to construct a siNrf2 cell model to verify that SSB maintains cellular barrier function through activation of the Nrf2/ARE pathway. Results The TEER values and the protein levels of ZO-1 and Occludin-1 in the PA+LPS+SSB group were significantly higher than those in the PA+LPS group （P<0.05）. The intracellular malondialdehyde （MDA）， 4-hydroxynonenal （4-HNE）， protein carbonyl content （PCC） and ROS in the PA+LPS group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）， while the intracellular 4-HNE， MDA， PCC and ROS in the PA+LPS+SSB group were significantly lower than those in the PA+LPS group （P<0.05）. The protein levels of Nrf2 and p-Nrf2， mRNA levels of Nqo1 and Ho-1， catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD） enzyme activities in the PA+LPS+SSB group were significantly higher than those in the PA+LPS group （P<0.05）. ZO-1 and Occludin-1 in the PA+LPS+SSBsiNrf2 group were significantly lower than those in the PA+LPS+SSB group at both protein level and transcript level （P<0.05）， and the levels of ROS， 4-HNE， MDA and PCC were significantly higher than those in the PA+LPS+SSB group （P<0.05）. Conclusion Saikosaponin B increase the antioxidant capacity of intestinal epithelial cells through activating the Nrf2/ARE signaling pathway， and inhibite oxidative stress and barrier damage induced by PA and LPS in Caco-2 cells， the present data indicate that SSB has a protective effect on intestinal epithelial cells.

[Key words] Saikosaponin B; Barrier damage; Nrf2/ARE; Oxidative stress

肠道屏障是由肠上皮细胞与肠上皮紧密连接蛋白（intestinal epithelial tight junctions，TJs）形成的具有选择性的物理屏障，允许离子、营養物质和水的定向吸收，同时抵御有害物（如肠道病原体，抗原和毒素）进入机体[1]。肠道屏障功能障碍导致有害物质入侵增加，引起系统性炎症反应，最终导致各种疾病，如炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）[2]。研究发现，富含棕榈酸（palmitic acid，PA）的膳食可显著增加小鼠肠道通透性，减少TJs蛋白表达，增加炎症因子白细胞介素-1β的表达和分泌[3-4]。因此，过量食用高脂膳食会引发炎症反应，破坏TJs的完整性和肠道屏障功能。中药柴胡含有大量的三萜类皂苷，由于其具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，已受到越来越多的关注[5-7]。研究表明，柴胡皂苷可以显著抑制脂多糖脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的急性肺损伤小鼠髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性和促炎症因子分泌[6]。在硫酸葡聚糖诱导的结肠炎小鼠模型中，柴胡皂苷A通过抑制核因子-κB的激活和重塑肠道微生物群而改善肠道炎症[7]。可见柴胡皂苷对细胞炎症和氧化应激表现出显著的药理活性，然而，柴胡皂苷B（saikosaponin B，SSB）改善高脂和LPS诱发的肠上皮细胞屏障损伤的相关研究报道较少。本实验旨在初步探讨SSB通过调节Nrf2/ARE途径对PA和LPS诱导Caco-2细胞损伤的保护机制，为SSB的临床开发利用提供理论基础。

1  材料与方法

1.1  材料与试剂

人结直肠腺癌细胞（Caco-2）购自于中国科学院细胞库（中国上海）。SSB（纯度>98%）和棕榈酸（palmitic acid，PA）购于中国阿拉丁生化科技股份有限公司，LPS购于美国Sigma-Aldrich试剂公司。过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蛋白质羰基含量（protein carbonyl content，PCC）检测试剂盒均购于中国南京建成生物工程研究所，DMEM培养基购于美国Gibco公司，荧光染料DCFH-DA购于中国碧云天生物技术有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂购于美国Invitrogen公司，其他化学试剂均为分析纯。

1.2  方法

1.2.1  细胞培养与药物处理  在常规条件下（37℃，5% CO2）的细胞培养箱中培养Caco-2，DMEM培养基含有10%血清和青霉素/链霉素。采用随机数字表法将细胞分为对照组（CON组，n=6），模型组（PA+LPS组，n=6）和柴胡皂苷B干预组（PA+LPS+SSB组，n=6），其中PA的浓度为200μmol/L，LPS浓度为10μg/ml，SSB的浓度为5μmol/L。

1.2.2  细胞活力测定  Caco-2细胞在96孔板中培养24h，加入含有不同浓度（0～20μmol/L）SSB的无血清DMEM持续培养不同时间。在每个孔中加入100μl的噻唑蓝染料溶液（0.5mg/ml），置于培养箱孵育4h。弃去培养基后，向每孔加入150μl的二甲基亚砜，采用Varioskan LUX多功能酶标仪（美国赛默飞世尔公司）测量570nm吸光度。

1.2.3  跨膜电阻（transendothelial electrical resistance，TEER）测定  采用PA（200μmol/L）和LPS（10μg/ml）共同处理Caco-2细胞12h，建立肠道上皮屏障损伤细胞模型。使用Millipore Millicell ERS-2 跨膜电阻仪（美国密立博公司）和筷子型电极进行电阻测定。达到单层汇合后，将Caco-2细胞用于TEER测量，分别在0、4h、12h测量电阻，并计算TEER值。TEER=（R1–R0）×A（Ω·cm2），其中R1为细胞孔电阻（Ω），R0为空白孔电阻（Ω），A代表膜面积（cm2），所有的TEER测量均在37℃下进行。

1.2.4  活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量测定  使用DCFH-DA荧光探针法测量ROS含量。细胞处理后，收集于离心管中，用10μmol/L的DCFH-DA避光孵育20min。将无血清DMEM清洗3次后，PBS缓冲液重悬细胞，采用Varioskan LUX多功能酶标仪（美国赛默飞世尔公司）分别测量细胞中ROS的荧光值，其中激发波长为488nm，发射波长为525nm。

1.2.5  敲降Nrf2  使用siRNA试剂盒（购于中国Origene生物科技有限公司）对Caco-2细胞进行Nrf2敲降。Caco-2细胞种于6孔板中，融合率达到80%后，细胞饥饿处理6h，利用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA转染细胞，并于48h后提取蛋白检测Nrf2表达水平。

1.2.6  定量聚合酶链反应（quantitative PCR，qPCR）  细胞经PBS缓冲液冲洗3遍，加入TRIzol试剂提取RNA并测量浓度，采用反转录试剂盒（购于中国诺唯赞公司）将mRNA反转录为cDNA。使用SYBR Green荧光染料（购于中国诺唯赞公司）进行qPCR分析以确定目的基因表达水平，引物序列见表1。采用2–ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.2.7  蛋白质免疫印迹  细胞经PBS缓冲液冲洗3次后，加入RIPA细胞裂解液，置于冰上裂解30min，采用BCA法测定裂解液蛋白含量，经SDS-PAGE电泳，转膜、封闭、孵育一抗和二抗、曝光显影。检测ZO-1、Occludin-1、Nrf2、磷酸化Nrf2的表达水平，并使用ImageJ软件对条带灰度进行量化分析。

1.4  统计学方法

采用GraphPad Prism 9.0统计学软件对数据进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析和Tukey检验，数据取3次以上独立实验的平均值。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  SSB对Caco-2细胞活力的影响

2.5μmol/L≤SSB≤10μmol/L时，Caco-2细胞活力与对未添加SSB的细胞相比，差异均无统计学意义（P>0.05）；当SSB浓度为20μmol/L时，Caco-2细胞活力明显低于未添加SSB的细胞（P<0.05）；用10μmol/L SSB处理细胞，6～24h内Caco-2细胞活力与0h比较，差异均无统计学意义（P>0.05），48h时的Caco-2细胞活力显著低于0h（P<0.05），见图1。因此，选择药物处理条件为5μmol/L处理12h，开展后续实验。

2.2  Caco-2细胞屏障损伤水平比较

4h和12h时，PA+LPS组Caco-2细胞的TEER值显著低于对照组（P<0.05），PA+LPS+SSB组TEER值显著高于PA+LPS组（P<0.01）。PA+LPS组的ZO-1和Occludin-1的转录水平和蛋白水平均显著低于对照组（P<0.05）；PA+LPS+SSB组的ZO-1和Occludin-1的表达水平均显著高于PA+LPS组（P<0.05），见图2。

2.3  Caco-2细胞氧化应激水平比较

PA+LPS组细胞内4-HNE、MDA、PCC和ROS含量均显著高于对照组（P<0.05），PA+LPS+SSB组的4-HNE、MDA、ROS含量和PCC均显著低于PA+LPS组（P<0.05），见图3。

2.4  Caco-2细胞中Nrf2/ARE信号通路水平比较

PA+LPS+SSB组细胞内Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平、Nqo1和Ho-1的mRNA水平、CAT和SOD酶活性均显著高于PA+LPS组（P<0.05），PA+LPS组CAT和SOD酶活性均显著低于对照组（P<0.05），见图4。

2.5  Nrf2/ARE信号通路保护作用比较

PA+LPS+SSB组的ZO-1和Occludin-1蛋白水平、转录水平均显著高于PA+LPS组（P<0.05）；PA+LPS+SSBsiNrf2组的ZO-1和Occludin-1蛋白水平、转录水平均显著低于PA+LPS+SSB组（P<0.05）；对照组和PA+LPS+SSB组的TEER值均显著高于PA+LPS组（P<0.05），见图5。PA+LPS+SSBsiNrf2组ROS、4-HNE、MDA含量和PCC均显著高于PA+ LPS+SSB组（P<0.05），PA+LPS+SSB组的ROS、4-HNE、MDA含量和PCC均显著低于PA+LPS组（P<0.05），见图6。

3  讨论

肠道上皮细胞作为肠道物理屏障，负责抵御肠腔内致病微生物、毒素和过敏原的入侵，是肠道屏障功能的重要组成部分[2]。高脂饮食会增加肠道通透性，导致肠腔中LPS和细菌代谢产物渗入机体，造成代谢性内毒素血症的发生[8]。其中，PA作为人类饮食中最常见的长链饱和脂肪酸之一，对人类的多种器官均有脂毒作用[9]。Ouyang等[3]发现高浓度PA（>400μmol/L）处理会增加Caco-2细胞屏障渗透性，抑制紧密连接相关蛋白（Claudin-1、Occludin-1和ZO-1）基因转录。Gori等[10]发现PA和LPS可以构建肠道屏障损伤体外模型，很好的模拟了高脂膳食引起的实验动物肠道屏障功能损伤。

研究发现柴胡皂苷可以通过靶向调控AMPK、MAPK、核因子κB等信号途径改善啮齿动物的肠道炎症和代谢紊乱[11]。然而，对PA诱导的肠道屏障功能损伤研究还未见报道。本研究使用PA和LPS联用构建肠道屏障损伤细胞模型，研究结果显示SSB干预缓解了PA+LPS引起的Caco-2细胞屏障受损，增加紧密连接蛋白（Occludin-1和ZO-1）的表达，有效维持细胞屏障完整性和功能。PA+LPS组可增加Caco-2细胞内ROS含量，导致大量脂质过氧化物（MDA、4-HNE和PCC）堆积。MDA和4-HNE是脂质/蛋白质过氧化的有毒代谢物，被广泛用作许多代谢性疾病发病过程中氧化应激的生物标志物[12-13]。同樣，过量的羟基自由基作用于蛋白质的肽键，在肽键断裂处产生羰基，破坏蛋白质功能，是机体内氧化压力水平升高的指标[14]，推测PA+LPS可导致Caco-2细胞内抗氧化系统受到抑制，ROS不能被充分清除，导致氧化还原失衡，进而引发屏障功能损伤的发生和恶化。有研究表明，柴胡皂苷通过增强抗氧化酶（CAT、HO-1、SOD和GST），降低MDA含量，对5-氟尿嘧啶诱导的肠炎小鼠的肠道组织有明显的保护作用，本研究结果与其一致[15]。

Nrf2/ARE是體内经典的抗氧化信号通路，调节多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达。有研究发现，过表达Nrf2可以改善高脂饮食引起的小鼠代谢紊乱和肠道屏障损伤[16]。SSB是Nrf2信号通路的潜在激动剂[17-18]，可明显减缓H2O2诱导的MDA和乳酸脱氢酶的释放，增加SOD和CAT酶的活性，从而减少细胞凋亡[17]。Lin等[18]发现，柴胡皂苷D可以通过清除ROS来抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，可能与阻断MAPK依赖的氧化损伤有关。本研究结果显示，SSB干预可以增加Nrf2和p-Nrf2的蛋白水平，其下游的靶基因Nqo1和Ho-1表达增加，抗氧化酶SOD和CAT的活性显著升高，说明SSB通过激活Nrf2/ARE抗氧化信号通路，清除PA和LPS诱导的ROS和脂质过氧化产物积累。此外，当敲降Nrf2时，SSB对Caco-2细胞的屏障保护作用消失，可见Nrf2/ARE信号通路是SSB发挥药效作用的关键途径。

综上所述，SSB通过激活Nrf2/ARE信号通路可增加肠道上皮细胞的抗氧化能力，抑制PA和LPS引起的Caco-2细胞氧化应激和屏障损伤。本研究初步揭示了柴胡皂苷B对肠壁屏障保护作用的新机制，为治疗肠道屏障功能障碍相关疾病提供了潜在的治疗药物。

[参考文献][1] 李静， 蒋春明. 肠道菌群及其代谢物在炎症性肠病肠道屏障中的作用[J]. 中国现代医生， 2022， 60（22）： 89–92.

[9] 郭海莲， 刘晓玲， 李鹏翠， 等. 游离脂肪酸及葡萄糖对鼠主动脉内皮细胞的影响及作用机制[J]. 中国现代医生， 2012， 50（10）： 4–7.

[18] LIN X， WU S， WANG Q， et al. Saikosaponin-D reduces H2O2-induced PC12 cell apoptosis by removing ROS and blocking MAPK-dependent oxidative damage[J]. Cell Mol Neurobiol， 2016， 36（8）： 1365–1375.