ATOH1相关的毛细胞再生新进展

刘宇昕 段清川 张杰

国家儿童医学中心首都医科大学附属北京儿童医院耳鼻咽喉头颈外科(北京 100045）

儿童耳鼻咽喉头颈外科疾病北京市重点实验室(北京 100045）

在毛细胞体系中，非哺乳动物的毛细胞损伤死亡后可以再生，而哺乳动物的毛细胞损伤后无法再生[1]，往往会造成听力障碍或永久性听力缺失，对于了解耳蜗毛细胞的发育、是否可以再生、再生机制、基因调控、是否存在靶点治疗途径，成为一直以来的热点。已有研究显示内耳发育和毛细胞再生是由多条信号通路共同调节，Wnt 信号通路、FGF 信号通路、Notch信号通路、BMP 信号通路等交互作用[2，3]。研究发现ATOH1（Atonal homolog 1）在毛细胞损伤时表达上调[4]，受多种信号通路的转录调控，是其中最为活跃的基因，在多种器官中的细胞再生中都起着重要作用，但这种多通道性也使得ATOH1表达不够专一，这种多通道调控表达模式仍需研究探讨，本文就ATOH1与其他基因共同表达时的毛细胞再生进展进行讨论。

1 ATOH1的多通道调控

ATOH1基因表达产物是一种螺旋-环-螺旋转录因子，又叫作MATH1基因，1999年研究显示胚胎ATOH1缺失小鼠未能产生耳蜗和前庭毛细胞，因此，ATOH1基因是毛细胞发生的必须基因[5]。相关实验表明，通过质粒或者腺病毒等作为载体的ATOH1过表达可以诱导耳蜗感觉上皮和非感觉上皮的毛细胞再生[6-9]。在多个系统中，ATOH1都与细胞再生有关，结肠中Lgr5+干细胞损伤后，ATOH1分泌祖细胞不仅可以参与Lgr5+干细胞的生成来修复损伤的结肠，且能够不依赖于Lgr5+干细胞生成途径而促进细胞再生恢复损伤的结肠[10]；而且ATOH1在神经系统发育的过程中，在很多区域它的表达都很活跃，ATOH1缺失小鼠会缺乏某种有助于本体感觉和前庭、听力功能以及呼吸功能的某种表达因子，可能与Shh 信号、Notch 信号与ATOH1交叉调控有关[11，12]。ATOH1在机体的表达过程中是由多通道调控的，研究ATOH1在各个系统中的作用机制有助于研究ATOH1在毛细胞的表达及作用，为毛细胞再生提示新思路。

ATOH1在毛细胞发育分化中同样受多种信号通路调控，例如BMP 信号通路、FGF 信号通路、Wnt信号通路、Notch 信号通路等[13]。研究表明BMP 通路主要是通过调节IDS基因的表达来调控ATOH1，IDS 蛋白与ATOH1表达的b-HLH 结合阻止功能二聚体的形成从而抑制ATOH1功能作用[14，15]。Notch信号通路则是通过抑制ATOH1的表达来阻止前体细胞分化为毛细胞，转而分化为支持细胞。研究表明Hes/Hey 结合在ATOH1启动子上能及时抑制ATOH1的表达,前体细胞最终向支持细胞方向分化[16]。腺病毒介导的ATOH1过度表达使大鼠小上皮嵴诱导异位毛细胞再生，但毛细胞转导率低，而当Notch 抑制剂DAPT 和ATOH1基因表达联合应用，通过降低Hes1和Hes5水平而增加ATOH1表达水平，使毛细胞转导率较前增加，表明抑制Notch信号通路可增加前体细胞向毛细胞转化的转导率[17]。Wnt信号通路和ATOH1协同作用，Wnt信号通路刺激能增加ATOH1基因的表达，当Wnt 被抑制时，ATOH1表达水平下降[18]。而β-catenin 通过与其3'增强子结合，激活ATOH1的表达，并可进一步被Wnt 途径促进，Wnt 信号存在时，β-catenin 积聚，而Notch 通路通过降低β-catenin，也可以降低ATOH1转录水平[19]。FGF信号通路可以通过激活MEKK4-ERK 通路来增加ATOH1基因的表达，且有文献推测通过抑制LSD1使FGF信号通路中的信号分子下调从而抑制毛细胞再生[19,20]，多种信号通路相互作用，共同调控，信号通路之间相互调控的还需要更深入的研究，对毛细胞再生甚至耳聋的发生机制及治疗都极为重要。

2 ATOH1 的相关调控因子相互作用调控内耳毛细胞生长发育

ATOH1是毛细胞再生过程中必不可少的基因，过表达ATOH1可以产生毛细胞样细胞，但毛细胞是一种具有接收机械信号并转化为电信号的感觉细胞，因此，毛细胞再生需要具有机械转导通道功能的毛束再生且存活。目前的毛细胞再生研究大多都只是通过激活相关基因表达产生毛细胞样细胞，但却不能接收淋巴液的机械刺激产生电信号，由于ATOH1的多通道调控机制，单一基因或途径可以导致毛细胞的再生，但具有正常生理功能的毛细胞可能需要操纵多种基因和途径的表达，目前对毛细胞生长和发育重要的细胞通路和基因的研究仍需不断深入，多种基因与ATOH1互相作用共同表达，可能是未来毛细胞再生治疗感应神经性耳聋的重要手段。

2.1 ATOH1与E2F转录因子

已知非哺乳动物在毛细胞损伤时可以产生新的毛细胞，这是由于前毛细胞Atoh1 激活再次表达[21]。之前的研究表明，ATOH1表达很大程度上依赖于两种下游顺式调节增强子，增强子A 和增强子B[22]。目前通过基因位点的比较分析，发现了之前推测的增强子C，其序列和位置在禽类中高度保守，但该序列目前未在小鼠和人类基因组中发现。通过结合生物信息学分析、EMSA 和报告基因分析，我们确定了ATOH1基因座与E2F（腺病毒早期基因2 结合因子）转录因子家族成员之间的新相互作用，E2F 是细胞周期的关键调节因子[23]。E2F1-3因子通过直接结合增强子C 内的一个调节元件来使禽类的Atoh1 表达增加，并且在耳毒性诱导的毛细胞再生过程中E2F1 的核质定位发生变化，这与Atoh1 的重新激活相一致，所以研究结果表明增强子C在毛细胞损伤后Atoh1表达重新激活毛细胞再生的过程中有着重要作用[24]。可能由于哺乳动物中增强子C 的缺失，哺乳动物该毛细胞ATOH1自主激活再生机制已丧失，所以未来是否可以通过改变哺乳动物ATOH1激活表达的途径来完成毛细胞再生是一可能治疗方式。

2.2 ATOH1与Gfi1转录因子

独立生长因子1(growth factor independent 1,Gfi1)，一种已知对造血干细胞自我更新和植入重要的锌转录阻遏物。GFI1 基因是ATOH1的下游靶点，也是POU4F3的下游靶点，POU4F3是另一个ATOH1调节的基因，对毛细胞的存活和成熟起着重要作用[6，25]。研究发现在小鼠胚胎干细胞中同时过度表达Gfi1、Pou4f3和Atoh1可显著诱导卵巢蛋白中毛细胞样细胞的有效分化[26]。在内耳，Gfi1 因子在ATOH1表达后不久在毛细胞中产生，是毛细胞正常发育存活所必需的因子。Gfi1 基因缺陷小鼠最初形成耳蜗毛细胞，但形成的毛细胞功能障碍，并最终死亡，这表明Gfi1 因子对毛细胞的存活很重要。虽然ATOH1是毛细胞再生过程中的必须基因，但其在成年哺乳动物耳朵中的转导率较低，且存活时间较短，所以尝试通过补充Gfi1来促进毛细胞的再生。在成熟的Pou4f3DTR小鼠中进行体内实验，通过注射白喉病毒进行消融完全清除其毛细胞。耳蜗支持细胞中分别使用Atoh1或Atoh1+Gfi1的腺病毒表达诱导毛细胞样细胞的出现，与Atoh1单独表达相比，Atoh1+Gfi1表达在4周后新的毛细胞样细胞数量增加6.2 倍，且能够存活至8 周，在新生儿耳蜗外植体中的数量同样增加[27]。因此，ATOH1和GFI1联合诱导表达的新方法可能是成年哺乳动物耳蜗毛细胞成功再生的重要进展。

2.3 ATOH1与Ikzf2调节因子

Ikzf2(Helios)是外毛细胞基因的一个候选调节因子，Ikzf2 因子在内毛细胞中的异位表达诱导了外毛细胞特异性基因的表达，降低了典型内毛细胞基因的表达，并赋予了内毛细胞外毛细胞的电性，这表明Ikzf2 因子能够部分地将内毛细胞转录组向外毛细胞样细胞转变[28]。之前的实验表明，可以通过分析细胞类型的特异性基因的启动子来发现相关的转录调控因子，用以识别统计过度表达的转录因子结合基序[29]。通过对外毛细胞标记基因的转录因子的结合基序分析最终发现只有Ikzf2 在外毛细胞中所有时间点均富集[30]。种种数据表明Ikzf2在外毛细胞各个时期的转录调控中都发挥着重要作用。在之前的研究中，从耳蜗支持细胞中再生新的外毛细胞均缺乏外毛细胞运动蛋白Prestin 的表达，Prestin 运动蛋白是外毛细胞功能的结构基础。而最新的研究报告成年小鼠耳蜗支持细胞通过同时诱导Atoh1 和Ikzf2 两种转录因子的表达，成功转化为有Prestin表达的外毛细胞样细胞，成功建立了一种具有部分功能结构的外毛细胞再生方法[31]。

2.4 ATOH1与BARHL1 3’增强子

Barhl1是果蝇BarH 类同源框基因的小鼠同源基因，在内耳内高度表达，对调节听觉和平衡的听觉毛细胞的长期维持至关重要[32]。BARHL1是ATOH1的直接靶基因，而其中BARHL13'增强子中的一个E 盒（E3）对ATOH1表达的b-HLH 介导的BARHL1激活至关重要。破坏E3位点，会导致BARHL1表达显著缺失，诱导的毛细胞样细胞数量显著减少，但是对早期原始外胚层样细胞和耳祖细胞的分化并没有影响，所以研究证明对于体外毛细胞样细胞再生、分化，BARHL13'增强子必不可少[33]。ATOH1通过与特定E3盒结合来调节BARHL1的表达，BARHL1作为ATOH1的下游基因，当E3 盒基因突变时则会影响毛细胞的分化，研究相应的耳聋发病机制能有效推进治疗研究进展。

2.5 ATOH1与TUB、ZNF532转录因子

研究发现耳蜗外侧大上皮嵴内的Sox2+祖细胞进行电穿孔感染，对细胞损伤小，用电穿孔方法进行转染来研究ATOH1与其他基因共同表达时的HC 转化效果可能更好[34]。Isl1 促进HC 的转化，而转录因子TUB、ZNF532是Isl1的下游靶点基因表达产物，美国一项研究将Atoh1与在HC 中高度表达的16 个转录因子单独或共同进行电穿孔转化，并在过程中不断进行电穿孔方法的优化，测试电穿孔的电流和质粒浓度，最终发现TUB、ZNF532 转录因子与Atoh1 基因产物被共同表达时会提高Atoh1的表达产物转化率，大上皮嵴细胞转化成毛细胞样细胞的数目明显提升[35]。在今后的实验中可以采用电穿孔方式来研究ATOH1与多个相关基因的再生作用，可能转录因子之间相互作用促进ATOH1介导的HC转导。

3 结语与展望

人类和其他哺乳类动物均丧失了自我再生毛细胞的能力，临床上毛细胞损伤最终会导致严重的听力损伤。ATOH1是耳蜗毛细胞发育过程的一个重要基因。ATOH1与其他基因联合表达来治疗毛细胞损伤导致的感应神经性耳聋是一个值得研究的问题。可以从蛋白表达层面分析毛细胞产生时的活跃表达基因，但活跃基因与ATOH1共同表达未促进HC转化也可能是因为该基因为某作用基因的下游靶点，所以可能要多个基因共同表达来研究相关基因在再生过程中的作用，然后联合表达促进转化基因尝试毛细胞再生，想得到完整且具有功能的毛细胞,仍是一个漫长的研究过程。