杜仲腰痛丸对脊髓损伤后NLRP3炎症小体表达的影响

元宝华 李兴勇 方鹏飞 蔺海生 刘晓婷

摘要：目的 观察杜仲腰痛丸对大鼠脊髓损伤后NLRP3炎症小体表达的影响，探讨该药对脊髓损伤后炎症反应的作用和其作用原理

方法 将50只SD大鼠随机分成5组，每组10只。分别是A组（低剂量组）、B组（中剂量组）、C组（高剂量组）、D组（模型组）、E组（假手术组）。A组、B组、C组与D组进行脊髓损伤造模，E组行椎板切除术。A组、B组、C组分别按照浓度梯度给予杜仲腰痛丸干预，D组和E组则给予同等量的生理盐水干预，实验的前后每组分别采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）运动能力评定量表评估大鼠后肢的联合运动功能，实验第7天取材检测NLRP3蛋白的相对表达，并分析其结果。

结果 术后A组、B组、C组的BBB评分均优于D组（P<0.05），治疗效果有时间依赖性；免疫组化法D组同E组相比较，D组NLRP3炎症体表达相对比较高，差异有统计学意义（P<0.05）；A组、B组、C组与D组相比较，A组、B组、C组NLRP3表达相对减少，C组的表达相对最少，差异有统计学意义（P<0.05）。

结论 证实杜仲腰痛丸可以抑制脊髓损伤部位NLRP3的表达，减缓炎症反应。

关键词：杜仲腰痛丸；脊髓损伤；NLRP3；炎症反应

中图分类号：R285.5

文献标志码：B

文章编号：1007-2349（2023）07-0001-03

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是脊柱节段控制系统和自主神经系统被破坏，导致痉挛性麻痹、疼痛感觉迟钝、交感神经迟钝和副交感神经兴奋，产生心律失常、全身性低血压、支气管收缩、呼吸道产生大量分泌物、肠道、膀胱和性功能障碍等症状，具有比较高的发病率以及致残率［1-4］。由于血脊髓屏障的破坏，损伤部位组织缺血，循环系统内炎症细胞趋化因子诱导损伤组织周围发生炎症反应，致使炎症反应介导周围组织坏死和凋亡。而在SCI后众多病理反应中，炎症反应对机体产生影响最大。杜仲腰痛丸（由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鳖虫等组成）常用于治疗脊柱源性疾病，研究证实杜仲腰痛丸可以抑制炎症反应，起到缓解疼痛的作用［5-6］。但杜仲腰痛丸能否抑制SCI后NLRP3炎性小体介导的炎性反应，尚未有这方面的实验研究。本研究将杜仲腰痛丸应用于脊髓损伤动物模型，观察其对SCI后NLRP3炎症体表达的影响，并探讨其中机理。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠50只，6-8周龄，体重（210±9.70）g，于中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心购得，许可证号码：SCXK（甘）2020-0002，所有大鼠按照动物实验管理与操作实用指南进行照料和处理，每笼5只，在相同条件下饲养，适应性喂养为期1周，若此期间实验动物没有出现不良反应，继而开展相关实验。

1.1.2 实验材料 杜仲腰痛丸，组成包括杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鳖虫等十七味中药，每瓶220丸，每粒含生药0.18 g，由甘肃省中医院制剂中心生产，产品批号：210653。配制成每毫升含生药0.05 g的药液，无菌条件下装入试剂瓶冰箱低温冷藏保存備用。实验中用到的试剂：兔抗鼠NLRP3抗体（Proteintech）；免疫组化试剂盒（博士德）。

1.2 实验方法 50只SD大鼠被随机分成5组，每组10只。分别是A组（低剂量组）、B组（中剂量组）、C组（高剂量组）、D组（模型组）、E组（假手术组）。所有大鼠均用1％戊巴比妥钠（60 mg/Kg）腹腔注射麻醉。8％Na2S背部脱毛，常规消毒后铺无菌洞巾，定位棘突后以T10棘突为中心，用手术刀切开皮肤形成一道长约3cm的切口，钝性剥离周围软组织后显露T10、T9、T11的棘突，并用蚊式咬骨钳咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，形成大小约4×8 mm的骨窗，暴露脊髓背侧硬膜，用止血钳轻夹脊髓，出现后肢伸展和甩尾反射则标志着建模成功，形成中度及重度脊髓损伤模型。E组（假手术组）只进行椎板切除，脊髓没有受到压迫。局部使用适量青霉素，预防施术部位发生感染，逐层缝合关闭切口，术中所有操作必须在无菌条件下进行。为防止术后感染，给予青霉素腹腔注射3 d，4万单位／N／只。观察大鼠皮肤有无损伤或感染，必要时继续注射青霉素。保持室温20～25℃，相对湿度在50%～65%，提供（12 h光照/12 h黑暗）稳定的昼夜光照变化，保持24 h通风换气，大鼠在整个实验期间可自由获取食物和水。为防止大鼠聚集舔舐背部伤口，所有大鼠均在清洁环境下单笼饲养。食物为商用大鼠颗粒饲料，饮水瓶为无毒耐高压塑料材料制成，饮水和饮水瓶经过高温灭菌消毒后使用，每日定时投食更换饮水，确保大鼠有充足的营养供给。每天进行两次人工排尿，并清除大鼠尿道附近污渍并消毒，以防止尿路感染，一直持续到大鼠恢复自主排尿功能。造模成功之后，A组给予杜仲腰痛丸汤剂灌胃，给药剂量为0.42 g/（kg·ｄ），每日2次；B组给予杜仲腰痛丸汤剂灌胃，给药剂量为0.84 g/（kg·ｄ），每日2次；C组给予杜仲腰痛丸汤剂灌胃，给药剂量为1.68 g/（kg·ｄ），每日2次；D组和E组分别给予等量的生理盐水，每日2次。连续干预7 d。所有动物均在实验期间存活，无不良反应，并纳入数据分析。

1.3 观察指标 每组大鼠分别在术前及术后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d用 BBB肢体运动功能评分（范围为0～21分）；术后第7 d取材，运用免疫组化法检测NLRP3炎症体表达。

1.4 统计学方法 运用SPSS20.0统计软件进行实验数据统计分析，实验数据收集用（x±s）表示，符合正态分布用ｔ检验或单因素方差分析，非正态分布资料用秩和检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

我们发现A组、B组、C组和D组的大鼠在SCI后立即失去后肢活动功能，治疗结果显示杜仲腰痛丸能促进神经元功能恢复，并且有时间依赖性。我们的BBB评分（表1）显示，A组的功能恢复明显高于D组，表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的运动功能恢复。我们使用免疫组化技术评估了每组NLRP3炎症体的表达变化。

2.1 BBB评分 用BBB运动评定量表评定大鼠后肢的运动功能。于术前及术后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d，将各组大鼠置于开阔场地内自由活动，记录员（双人、双盲）负责对每只大鼠的后肢运动能力评分。每只大鼠的运动评分最终结果取平均值，得出结果值并进行统计学分析（表1）。

与E组相比较，A组、B组、C组和D组的BBB肢体运动功能评分显著下降，但是随着治疗时间的延长，A组、B组、C组和D组的BBB肢体运动功能评分逐渐升高，到手术后第3天开始，A组、B组、C组BBB肢体运动功能评分优于D组同时期的结果（P<0.01）（见图1）。这表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的运动功能，促进神经元的恢复。

2.2 免疫组化学法检测NLRP3炎症体的变化 运用免疫组化学法检测，NLRP3炎症小体阳性表达呈深灰褐色，表达的位置主要在细胞浆之中（见图2）。E组只能观察到少量的NLRP3炎症小体表达，D组中NLRP3炎症小体在细胞浆中大量表达（见表2），A组的NLRP3炎症体表达量明显少于D组，差异有统计学意义（P<0.05）（见图3）。

3 讨论

本实验研究显示，运用免疫组化学法检测，NLRP3炎症小体阳性表达呈深灰褐色，表达的位置主要在细胞浆之中。E组只能观察到少量的NLRP3炎症小体表达，D组中NLRP3炎症小体在细胞浆中大量表达，A组、B组、C组的NLRP3炎症体表达量明显少于D组，说明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，减轻脊髓损伤后继发的炎症反应，从而起到保护神经细胞的作用。

炎症反应是造成脊髓继发性损伤的主要原因，脊髓损伤后使小胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞被激活，这些细胞会分泌大量的炎性细胞因子和趋化因子，致使炎症区域扩大，形成纤维蛋白凝块和胶质瘢痕，并释放大量抑制神经和突触修复的细胞因子（如 IL-1、TNF-α和 IL-6），炎症反应进一步加重，从而让中枢神经系统的再生和修复变的更加艰难［7-9］。

NLRP3炎性小体是免疫系统实现免疫功能重要的一个组成部分，作为caspase-1的激活平台，它可以控制细胞炎症因子和细胞因子的处理和释放［10-11］。NLRP3在特定的条件下被激活后，使caspase-1发生活化，活性的caspase-1则会促进IL-1β和IL-18的活化［12-13］，IL-1β和IL-18都促进活性氧（ROS）的积累，而ROS又充当损伤相关的分子模式（DAMPs），使NLRP3炎性体被激活和caspase-1发生活化，进一步产生IL-18和凋亡激活，从而引起反馈环，使炎症反应进行性加重［10，14］。NLRP3激活的确切机制和它调节炎症反应的机理，尚未研究透彻，但可能有多种调节机制和分子对NLRP3炎症反应起积极或消极的调节作用。SCI使NLRP3激活产生促炎细胞因子会产生炎症環境，从而加剧SCI的炎症反应，从而恶化疾病的预后。

大量研究表明，中医药在治疗SCI上有其独特的经验和优势［15］。杜仲腰痛丸由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鳖虫等组成，具有补益肝肾，通督脉、止痛消肿的功效。文献研究表明服用杜仲腰痛丸后患者临床症状明显改善，血清IL-1、TNF-α的水平降低，IL-10水平升高，这表明杜仲腰痛丸有抗炎、缓解疼痛的作用［6］。

综上所述，根据本实验研究的结果，说明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，从而减轻脊髓损伤后继发的炎症反应，起到保护神经细胞的作用。但是具体的作用过程还未可知，是直接结合NLRP3炎性体从而抑制炎性反应，或者是通过其他途径来影响NLRP3炎性小体的激活，其中原理还需要在以后的实验研究中去探究证实。

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（收稿日期：2022-70-18）