秦川牛宰后成熟期间热休克蛋白A6对肉品质变化的影响机制

马旭华，李亚蕾，罗瑞明，张杏亚

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021）

动物宰后缺氧缺血状态激活了细胞凋亡酶，在诱导细胞凋亡的同时，还诱导了热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）的合成，HSPs主要功能是作为分子伴侣与抗凋亡因子，通过阻止宰后肌肉成熟过程中的细胞凋亡、蛋白降解等对肌肉结构发挥防护作用[1]。诸多研究表明，HSPs作为生物标记物在预测嫩度、肉色、保水性方面具有一定潜力[1-2]。丁振江[3]研究发现HSP27可能通过抑制内源酶活性从而延缓宰后牛肉成熟。Bernard等[4]研究夏洛莱牛胸部肌肉时发现，HSP27表达下调能够改善肉嫩度、多汁性和风味。HSP70家族是HSPs最重要的亚族之一，HSPA6是其家族成员之一，在活体细胞中的各个部分组成性地表达[5]，其功能发挥对与ATP结合、ATP-ADP转化或HSPA6磷酸化诱发构象变化具有依赖性[6]。动物宰后缺氧缺血信号会调节组织能量水平变化，鲜肉贮藏期间线粒体结构受损、功能失调、呼吸功能中断等引起氧化还原状态紊乱，使能量物质发生不同程度的降解。罗辉等[7]研究发现宰后牛肉中能量基本物质水平持续下降。Kopuzlu等[8]研究表明肉牛宰后初期肌肉内葡萄糖及糖原有氧分解迅速转变为无氧酵解，产生乳酸，pH值持续下降，体内ATP酶催化ATP水解。能量代谢在宰后肌肉向肉品转化过程中与酸度、肉色、嫩度、保水性及风味等紧密相关。

蛋白质组学是研究特定状态或时期下组织或细胞全部蛋白质水平变化。目前，蛋白质组学方法在肉品质变化机制研究方面已有较为广泛的应用[9-10]。在3D分离基础上，4D-非标记定量（4D-label free quantification，4D-LFQ）蛋白质组学技术增加了离子淌度参数，主要根据离子截面及形状进行分离，为测定秦川牛肉组织这种复杂体系样本提供更多的可能。Jia等[11]采用Label-free蛋白质组学研究牛胸最长肌肌浆蛋白时发现，通过检测活体组织或宰后牛胸最长肌中Peroxiredoxin-6含量可预测嫩度变化。Boudon等[12]采用Label-free蛋白质组学研究夏洛莱×奥布拉克牛肉嫩度生物标志物，发现HSP90AA1可用于肉嫩度预测推定候选蛋白质。魏燕超[13]采用稳定同位素标记蛋白质组学技术（isobaric tag for relative and absolute quantitation，iTRAQ）结合液相色谱串联质谱联用（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术研究HSPs表达水平与羊肉嫩度之间关系，发现HSPs表达水平决定了不同品质羊肉嫩度。综上，蛋白质组学可应用于研究与肉品质相关的蛋白质，包括HSPs。HSP70是HSPs家族中最重要亚族之一，目前鲜有研究阐释宰后成熟期间肉中HSP70家族成员与能量水平关系，因此，本研究以宰后4 ℃条件下秦川牛背最长肌为研究对象，测定其能量水平变化和肉品质变化，采用4D-LFQ技术分析不同贮藏期牛肉蛋白质水平变化，结合基因本体注释（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，从分子层面明确HSPA6参与调控的通路，研究HSPA6影响能量代谢的途径，为后续从HSPA6变化角度阐明宰后肌肉组织能量代谢和品质变化机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

体质量相近的25 月龄秦川公牛由宁夏尚农生物科技产业发展有限公司提供。

三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素、三乙基碳酸氢铵 美国Sigma-Aldrich公司；胰酶美国Promega公司；蛋白质酶抑制剂 上海Calbiochem公司；乙腈 美国Fisher Chemical公司；甲酸 瑞士Fluka公司；BCA试剂盒 江苏碧云天公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

NAI-CS150超声波细胞破碎机 上海那艾精密仪器有限公司；MiniVac Alpha冷冻离心机 美国Scan Speed公司；timsTOF Pro质谱仪、NanoElute超高效液相色谱仪德国Bruker公司；Forma 994－80 ℃超低温冰箱美国Thermo公司；TA-XT plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；UV-1200紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

采样对象选用屠宰后的左胴体背最长肌，背最长肌样品平均分割成3 份，共计15 个样品（每个样品约150 g）。样品分割成块编号后用聚乙烯薄膜包裹，贮存于4 ℃的冰箱中。采集贮存0、2、4、6、8 d的样品用于测定秦川牛肉品质指标；对于不便立即测定指标的样本，将手术刀及镊子进行灭菌处理后，分别采集不同成熟期样本10 g置于液氮中，速冻2 h后转移至－80 ℃冰箱保存，待检测分析使用。

1.3.2 能量基本物质含量的测定

精确称50 mg样品置于离心管中，加入4 ℃预冷0.6 mol/L高氯酸和1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）混合液1 mL，匀浆2 min后离心，4 ℃、10 000×g条件下10 min，取700 μL上清液加0.2 mL 1 mol/L的NaOH溶液。摇匀反应5 min，取0.5 mmol/L上清液过膜后－80 ℃冰箱保存。高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法检测三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH）含量[14]。HPLC条件：流动相：220 mmol/L硫酸钾（溶剂为体积分数10%甲醇溶液，四丁基氢氧化铵调pH值至6.5），等比洗脱，流速设置为0.8 mL/min，检测波长设置为254 nm。

1.3.3 剪切力测定

参考李桂霞等[15]方法稍作修改。取肉块约3 cm×6 cm×6 cm，除去表面脂肪和筋膜，置于蒸煮袋内，抽去袋内空气，使肉块表面紧贴蒸煮袋，密封袋口，置于80 ℃水浴锅加热至中心温度70 ℃后立即取出，冷却至室温，将肉样沿肌纤维方向用直径1.27 cm采样器平行取4 个肉柱，然后用TA-XT plus质构仪V型活动剪切刀架垂直于肌纤维方向测定其剪切力，剪切速率与剪切距离分别为1.5 mm/s、40 mm，4 次测定取其平均值。

1.3.4 肌原纤维小片化指数的测定

参考Culler等[16]方法稍作调整。称取经过修整的1 g肉样于冷冻研磨仪搅碎，放入离心管加入经过预冷（4 ℃）的10 mL缓冲液（含KCl 100 mmol/L、K2HPO411.2 mmol/L、KH2PO48.8 mmol/L、EGTA 1 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaN31 mmol/L），1 200 r/min匀浆2～3 次（每次1 min，两次间隔1 min），放入离心管4 ℃、1 000×g离心15 min收集上清液，加入10 mL缓冲液再次匀浆后离心，去上清液，再加入5 mL预冷缓冲液使沉淀充分悬浮后用200 目筛过滤沉淀，再用5 mL缓冲液清洗离心管后过200 目筛，收集缓冲液，采用考马斯亮蓝法测蛋白质量浓度。用缓冲液将蛋白质量浓度稀释至0.5 mg/mL，在595 nm波长处重复测定3 次吸光度，取平均值带入式（1）计算肌纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）。

1.3.5 离心损失率的测定

参考Zhang等[17]方法并稍作调整。将不同贮藏时间的牛肉样品分别切成4.0 cm×0.5 cm×0.5 cm，于10 mL离心管中称质量，40 000×g、4 ℃离心15 min，吸干肉样表面水分，称其质量。按式（2）计算离心损失率。

式中：m1为离心前样品质量/g；m2为离心后样品质量/g。

1.3.6 4D-LFQ蛋白质组学技术检测蛋白质含量

参照张杏亚等[18]的方法提取蛋白质并测定蛋白质含量，参照罗辉等[19]的方法进行数据库搜索、生物信息学分析，筛选差异蛋白质利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）作GO、KEGG通路分析。

1.4 数据处理与分析

所得数据以平均值±标准差表示，运用SPSS 24软件单因素方差分析和Duncan法进行比较，确定数据间是否具有显著性差异，P＜0.01为差异极显著，P＜0.05为差异显著，利用Origin 8.0软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 宰后牛肉贮藏过程中品质的变化

2.1.1 HSP70家族成员筛选及其表达量变化

采用4D-LFQ蛋白质组学技术研究秦川牛宰后蛋白质组的丰富度变化，利用Maxquant（v1.6.6.0）软件对所得的蛋白质二级结构进行质谱检索，共鉴定出1 149 个蛋白质，通过逐一搜索，仅筛选出HSP70家族成员HSPA6，其表达量变化情况如表1所示。HSPA6表达量在宰后0 d最大（1.51），随贮藏时间延长呈显著下降趋势（P＜0.05）。宰后初期由于动物缺血缺氧引起应激反应，HSPA6作为应激分子迅速被合成，因此0 d时其表达量较高，随成熟时间延长，蛋白质降解程度加剧，使其表达量显著降低。0～4 d其表达量降幅较低，表明少量HSPA6发生降解；4～8 d降幅较大，表明HSPA6降解主要发生在成熟后期。因此，牛肉宰后的成熟初期HSPA6能够较好地执行其功能。

表1 宰后贮藏过程中秦川牛背最长肌HSPA6表达量的变化Table 1 Changes in HSPA6 expression in beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.2 能量代谢基本物质ATP、ADP、AMP、NADH含量的变化

采用HPLC法检测宰后秦川牛背最长肌能量代谢基本物质含量，结果如表2所示。随着贮藏时间的延长，ATP含量呈显著下降趋势（P＜0.05），由0 d时的9.63 μmol/g下降至8 d时0.50 μmol/g，0～2 d期间下降速率较快，2～8 d降幅较缓，8 d时基本检测不出ATP。ADP、AMP的含量在整个成熟期（0～8 d）均呈显著下降趋势。结果表明，宰后由于有氧代谢逐渐减弱，组织中ATP迅速发生降解，促使糖酵解被激活，同时引起AMP、ADP含量下降。贮藏过程中NADH含量变化可反映组织细胞中氧化还原和能量变化状态。0～8 d期间NADH含量逐渐降低，引起该现象的原因可能是宰后肌肉组织细胞中线粒体受损，呼吸功能失调[18]。

表2 秦川牛背最长肌在贮藏时间过程中ATP、ADP、AMP、NADH含量的变化Table 2 Changes in ATP,ADP,AMP and NADH contents in beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.3 剪切力的变化

肉的嫩度直接影响其食用时的口感，故嫩度是牛肉的重要品质指标之一[20]。而剪切力是评价肉品宰后成熟过程中嫩度的重要指标，其代表肌肉纤维对抗剪切的作用力。宰后成熟期间秦川牛背最长肌剪切力变化趋势如表3所示。牛肉贮藏0 d时剪切力为121.67 N，0～4 d期间显著上升，4 d达到其最大值（155.03 N），4～8 d呈显著下降趋势，8 d时剪切力为94.3 N。剪切力变化趋势表明，宰后初期秦川牛肉嫩度较差，这可能是因为宰后初期肌凝蛋白凝固、肌纤维硬化，肌肉发生僵直，贮藏至8 d时嫩度较好，本研究结果与Rhee等[21]对韩国本土牛肉的研究结果一致，秦川牛肉剪切力变化分析结果表明宰后成熟有助于改善肉品嫩度，适度条件的成熟有助于改善肉品嫩度是因为宰后内源酶被激活，有效加速细胞骨架蛋白的降解。

表3 秦川牛背最长肌在贮藏过程中剪切力、MFI和离心损失率的变化Table 3 Changes in shear force,MFI and centrifugal loss of beef Longissimus dorsi muscle of Qinchuan cattle during storage

2.1.4 MFI的变化

MFI代表肌原纤维蛋白被降解及肌原纤维结构破坏的程度，能反映细胞骨架蛋白碎裂程度，常被用于间接表征肉品的嫩度[22]。如表3所示，MFI随成熟时间延长呈显著上升趋势（P＜0.05），贮藏0 d时MFI为30.30，8 d时达到整个贮藏过程的最高值（99.00），与0 d时相比增长了226.73%。MFI变化趋势表明，随着贮藏时间的延长，秦川牛肌肉结构蛋白的水解程度加剧，肌肉结构蛋白质在内源酶的作用下被降解为片段。李升升[23]在牦牛平滑肌嫩度形成机理的研究中发现，牦牛平滑肌的MFI随冷藏时间延长而显著上升（P＜0.05），本研究结果与其一致。

2.1.5 离心损失率的变化

离心损失率常被用于表征肉的保水性，能够反映在施加离心力时牛肉保持其自身水分及吸收水分的能力[24]。如表3所示，宰后0～4 d时牛肉的离心损失率显著升高，4 d时达到最大值，4～8 d显著降低。表明4 d时牛肉中肌浆蛋白凝结到肌原纤维上，蛋白质溶解度下降，造成了水分的流失，离心损失率达到最大，保水性最差。

2.1.6 HSPA6表达量与能量物质及品质指标的相关分析

为探究宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6与能量物质及肉品质的关系，对HSPA6表达量与能量基本物质及品质指标进行Pearson相关性分析。由表4可知，宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6表达量与ATP含量、ADP含量、AMP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关（P＜0.05），相关系数r分别为0.529、0.542、0.578、0.737、0.550；与MFI、离心损失率呈极显著负相关（P＜0.01），相关系数r分别为－0.771、－0.153；与ADP、AMP含量无显著相关性。HSPA6具有分子伴侣、免疫调节、抗癌细胞增殖、抗细胞凋亡等功能，可保护组织免受氧化应激，保护重要蛋白质不发生不可逆变性[25]。动物宰后机体由于缺血、缺氧会刺激HSPA6表达，HSPA6的表达量与细胞损伤程度成反比[26]，这说明HSPA6对细胞结构具有保护作用。本研究中宰后成熟初期HSPA6仅发生少量降解，能够较好地执行其生理功能，抑制蛋白降解和细胞凋亡。随着贮藏时间延长，尤其是在贮藏后期，由于细胞凋亡酶发生作用，HSPA6对抗凋亡作用的能力降低，导致肌肉结构降解程度加剧，因而剪切力降低，嫩度增加。Zhang Muhan等[27]研究发现鸡胸肉中HSP70表达量与滴水损失率呈正相关，与本研究结果不一致，可能是实验材料存在差异或样品处理方式不同所导致。D’Alessandro等[28]通过牛肉的嫩度指标及其与蛋白质组学和代谢组学分析结果的相关性发现牛肉中HSP70表达量与嫩度呈正相关，与MFI呈负相关，本研究结果与其一致。di Luca等[29]采用蛋白质组学研究猪肉在成熟过程中保水性，发现HSPs表达量与滴水损失率呈负相关，滴水损失率大则系水率低；本研究中HSPA6表达量与离心损失率也呈极显著负相关（P＜0.01），二者结果一致。

表4 HSPA6表达量与品质各指标之间的相关性分析Table 4 Correlation analysis between the expression of HSPA6 and various quality indicators

HSPA6作为HSP70蛋白家族成员之一，具有其家族特有的两个亚结构域：N端高度保守ATPase功能域和C端底物结合功能域，ATPase功能域具有水解ATP的活性，可以处于与ATP、ADP结合状态或者无核苷酸结合状态，C端底物结合功能域可以与未折叠多肽底物暴露在外的疏水区域结合。HSP70 ATPase功能域的结合（与ATP结合）或水解状态（ATP→ATP，变成与ADP结合状态）会引起底物结合功能域与多肽的结合状态和结构的改变，因此HSP70通过C端底物结合、释放并伴随N端ATP-ADP转换来发挥功能，可以保护蛋白质免受压力、折叠的影响，促进错误折叠蛋白质的分解、形成蛋白质复合物和促进蛋白质复合物解离等。本研究中，宰后成熟期间秦川牛背最长肌中HSPA6表达量呈显著下降趋势，并与ATP、NADH含量呈显著正相关，结果表明HSPA6可能通过利用结构域具有ATP-ADP转换活性执行宰后成熟期间秦川牛肉中的蛋白翻译后修饰。Leu等[30]通过抑制应激诱导的HSP70表达，发现抑制HSP70表达会导致线粒体蛋白发生显著变化、线粒体膜电位降低、耗氧率降低、ATP损耗等，与本研究结果一致。

2.2 蛋白质组学数据分析

设置1.3 倍为标准差异倍数，4 d与0 d、8 d与0 d、8 d与4 d相比分别鉴定出30、61、31 个差异表达蛋白质，并对3 个贮藏时间段样品的蛋白质组学结果进行蛋白质组间相关性分析，如图1所示。结果表明，贮藏时间可将样本很好地区分开，同一贮藏时间样本之间区分不明显，不同贮藏时间样本之间区分明显，表明本实验样本采集合理，蛋白质组学数据可靠，满足后续分析要求。

图1 贮藏0、4、8 d背最长肌样品差异蛋白组间相关性分析Fig.1 Correlation analysis of differential proteins between Longissimus dorsi muscle stored for 0,4 and 8 days

2.2.1 差异蛋白质筛选

通过Uniprot数据库对鉴定出的差异蛋白进行逐一搜索，通过功能特性筛选出24 种与HSPA6表达相关的差异蛋白质，并将其表达丰度与HSPA6表达量进行相关性分析，结果如表5所示。

表5 秦川牛背最长肌贮藏0、4、8 d与HSPA6相关的差异蛋白对比Table 5 Comparison of HSPA6-related differential proteins between Longissimus dorsi muscle stored for 0,4 and 8 days

2.2.2 GO分析

对差异蛋白质及HSPA6通过GO富集分析，通过生物过程、分子功能、细胞组分解析其功能，显著富集到9 个生物过程、8 个分子功能、8 个细胞组分，如表6所示。此类差异蛋白质能够催化复合体、蛋白质复合体、细胞骨架部分等位置发生变化，同时在细胞内具有催化、水解酶等活性，并通过与碳水化合物衍生物、嘌呤核苷三磷酸结合等分子功能，引起蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白质分解代谢、蛋白分解参与细胞蛋白分解等生物过程，进而使宰后秦川牛肌肉结构发生变化，影响肌肉蛋白质水解，引起肉的能量水平及相关品质发生变化[31]。

表6 与HSPA6表达量相关差异蛋白的GO富集分析Table 6 Gene ontology (GO) enrichment analysis of differential proteins associated with HSPA6 expression

2.2.3 KEGG通路分析

对差异蛋白质及HSPA6进行KEGG通路富集分析，其显著注释于剪接体（bta03040）与内质网中蛋白质加工（bta04141），如表7所示。HNRNPK为异质性核蛋白K，是RNA结合蛋白，可能影响不均一核RNA的加工以及mRNA代谢和运输，在不均一核RNA剪接过程中介导ATP水解。DNAJA2为细胞周期进程恢复基因2，该蛋白属于进化保守DNAJ/HSP40蛋白家族，通过刺激ATP酶活性来调节分子伴侣活性，DNAJ蛋白在体外蛋白质折叠导入中作为HSP70的辅助伴侣。P4HB为蛋白质二硫键异构酶，来源于硫氧还原蛋白超家族的二硫醇-二硫化物氧化还原酶分子伴侣，具有氧化还原酶、异构酶和分子伴侣作用[32]。剪接体是由核小RNA和蛋白质因子动态组成，可识别RNA前体并催化核糖核蛋白复合体的剪接反应。内质网中蛋白质加工过程包括蛋白质的糖基化、酰基化、羟基化等。以上结果表明，HSPA6参与了宰后成熟期间秦川牛肉中蛋白质翻译后修饰。

表7 8 d对比0 d组差异蛋白KEGG通路富集Table 7 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of differential proteins in Longissimus dorsi muscle stored for 8 vs 0 days

2.2.4 基于蛋白质组学研究秦川牛宰后贮藏期间HSPA6及相关差异蛋白变化

已知HSP70 N端ATPase功能域具有微弱的ATP水解活性和ATP合成活性，即ATP-ADP转换活性[6]，可能会通过影响ATP合酶参与ATP合成与消耗从而影响机体细胞供能和耗能。HSPA6作为HSP70家族一员，缺血缺氧激活了细胞凋亡酶，同时应激诱导了HSPA6的合成，阻止宰后肌肉成熟过程中细胞凋亡，并保持或降低HSPA6对肌肉细胞蛋白质的影响[33]，然而其调控能量代谢变化及肉品质变化的机制尚不明确。

HSPA6及相关差异蛋白质主要在细胞质中发挥生物作用，并且HSPA6所含HSP70家族特有的EEVD基序可以与具有四肽重复结构域的伴侣蛋白结合，如E3泛素连接酶，同时伴侣蛋白之间存在竞争关系，DNAJB4限制了HSP70与E3泛素连接酶复合物的泛素化活性，而E3泛素连接酶抑制了HSP70-DNAJB4复合物重折叠活性[34]。因此，HSPA6在细胞质中可与DNAJB4、E3泛素连接酶等伴侣蛋白共同作用，同时作为维持蛋白质稳定的重要参与者，在蛋白质折叠和降解中发挥作用，控制应激状态下的蛋白质稳态[35]。HNRNPK是与mRNA结合的主要蛋白质，可能在RNA转录激活和抑制过程中发挥作用[36]，促进细胞糖基化，诱导细胞凋亡。DDX39B是参与剪接和未剪接mRNA核输出的主要蛋白，亦是组装TREX复合物的组分，在TREX组装过程中可能会经历几轮ATP水解，以驱动随后的成分加载到mRNA上，ATPase活性被RNA和TREX的复合体共同刺激，ATP水解触发了RNA的解离，参与转录延伸和基因组稳定。DDX3作为RNA解旋酶，其C端优先与未甲基化的HNRNPK结合[37]。已有研究发现，HNRNPK的精氨酸甲基化通过干扰DDX3-HNRNPK相互作用来抑制U2OS细胞的凋亡；另一方面，DDX3-HNRNPK具有促凋亡作用，DDX3-HNRNPK水平可以作为反映骨肉瘤细胞凋亡的程度[38]，与本研究结果一致。HSPA6可能通过ATP-ADP转换活性的功能降低组织能量水平，并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的肉色、嫩度及保水性。

3 结论

宰后0～8 d内，随贮藏时间的延长，秦川牛肉中HSPA6表达量持续下降，ATP、ADP、AMP、NADH含量持续下降，剪切力与离心损率失先升高后降低。利用4D-LFQ蛋白质组学分析发现，贮藏0～8 d秦川牛背最长肌所含HSPA6及相关差异蛋白质表达量发生变化，这些蛋白质位于催化复合体、蛋白质复合体、细胞骨架，通过与碳水化合物衍生物、蛋白质或嘌呤核苷三磷酸结合，参与蛋白质分解代谢，引起蛋白质降解、细胞凋亡和蛋白水解等变化，进而影响肌肉结构发生变化，导致组织能量水平降低，最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。