EZH2基因在宫颈癌顺铂耐药中的作用及机制*

陈茜, 王海燕, 刘宪, 刘佳

(1.西安交通大学第一附属医院 生殖医学科, 陕西 西安 710061; 2.陕西省肿瘤医院 胸外科, 陕西 西安 710061)

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤,近年来其发病有年轻化的趋势,严重威胁女性健康[1]。目前,对宫颈癌仍采用以手术和放疗为主、化疗为辅的综合治疗方法,其中化疗主要用于晚期或复发转移的患者。近年也采用手术联合术前新辅助化疗可缩小肿瘤病灶及控制亚临床转移、亦可用于放疗增敏,顺铂为常用化疗药物之一[2-3]。宫颈癌细胞对化疗药物产生的耐药性会严重地影响化疗药物的治疗效果。因此,探讨预测宫颈癌化疗敏感性的生物学指标,增强化疗药物敏感性,寻求逆转化疗耐药的新方法及靶向治疗为宫颈癌化疗耐药的处理提供新的思路。EZH2是多梳家族蛋白(polycomb-group proteins,PcGs)的重要组分,被认为与多种癌症类型有关,其突变、扩增和、或过表达与癌症进展和不良预后密切相关[4-6]。有研究表明EZH2的高表达导致肿瘤细胞耐药,如在乳腺癌中EZH2 过表达降低了肿瘤细胞对他莫西芬的药物敏感性[7],靶向作用于EZH2可能成为解决癌治疗化疗耐药的一个新策略。关于EZH2 在宫颈癌化疗耐药中的作用和机制研究较少,本研究通过在宫颈癌细胞中抑制或过表达EZH2基因,观察其对宫颈癌细胞顺铂耐药功能的影响及可能机制,为宫颈癌的化疗耐药问题提供理论支持,增强化疗药物敏感性,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞来源 人宫颈癌细胞系HeLa、SiHa购于美国ATCC细胞库。

1.1.2主要试剂与仪器 DMEM高糖培养基(美国Thermo Fisher Scientific),胎牛血清(美国Hyclone),青霉素、链霉素、MTT(美国Sigma),顺铂(山东齐鲁制药),GSK343(上海Selleck,工作浓度10 umol/L),Lipofectamine2000(美国Invitrogen),EZH2-sh质粒及其control 质粒(上海吉玛制药技术公司),兔抗人EZH2单克隆抗体(美国CST),鼠抗人单克隆抗体ABCG2和GAPDH(美国Santa Cruz),二氧化碳培养箱(德国Heraeus),光学倒置显微镜(日本OLYMPUS),酶标仪(美国Epoch)。

1.2 方法

1.2.1细胞转染及分组 按照LipofectamineTM2000转染说明书将构建的EZH2真核表达质粒和对照转染至HeLa细胞、EZH2 shRNA和对照转染至HeLa和SiHa细胞,筛选稳定的阳性克隆细胞,用Western blot鉴定作为实验的工具细胞[8]。

1.2.2宫颈癌细胞对肿瘤药物顺铂的耐药性 将处于对数生长期过表达或干扰EZH2的细胞通过胰酶消化后,制成单细胞悬液,按照4×104(或1×104)的细胞浓度接种于96孔细胞培养板中,每孔加入200 μL 的培养基,待细胞贴壁后、更换为含有不同浓度包括3、6、12、24、48 mg/L(或4 mg/L)顺铂的培养基进行培养,培养48 h(或24 h、48 h、72 h)后,吸弃各孔内的培养基,分别加入5 g/L MTT(100 μL),37 ℃孵育4 h后吸弃各孔中的上清液,分别加入DMSO(100 μL),于摇床震荡10 min后,用酶标仪测定490 nm波长处每孔的光密度值(D),每组均设置3个复孔。

1.2.3宫颈癌细胞系HeLa、SiHa顺铂耐药细胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP建立 将处于对数生长期的HeLa(SiHa)细胞通过胰酶消化后接种于35 mm培养皿中,细胞密度生长至50%时,加入0.1 mg/L顺铂持续处理15 d时、分别于0.2、0.3、0.4、0.5(SiHa细胞0.4、0.8、1、2)mg/L的顺铂中培养1周,获得稳定生长且对顺铂耐药的细胞株分别命名为HeLa-DDP和SiHa-DDP细胞,以终浓度为0.5(SiHa细胞 2)mg/L顺铂中长期培养,以维持细胞的耐药性。

1.2.4实时荧光定量PCR(qRT-PCR) TRIzol 法提取细胞中的总RNA、并反转录,反转录条件为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃,以反转录产物为模板进行实时荧光定量PCR,GAPDH为内参。引物序列:GAPDH-F为GCACCGTCAAGGCTGAGAAC,GAPDH-R为TGGTGAAGACGCCAGTGGA,ABCG2-F为CAAGAGCAGGCAGGAAGGAA,ABCG2-R为GTGTGACGCTGGAAGCAAAG,EZH2-F为TGCGACTGAGACAGCTCAAG,EZH2-R为GCGCAATGAGCTCACAGAAG。按照SYBR®Premix Ex TaqTM说明书操作,反应条件为Step1(1 Cycle)95 ℃ 30 s,Step2(40 Cycles)95 ℃ 5 s 60 ℃ 30 s,Step3 Dissociation(1 Cycle),实验重复3次。

1.2.5Western blot 分析 从细胞中提取蛋白,以BCA 蛋白定量法测定蛋白质浓度。蛋白经10% SDS-PAGE 电泳,应用Bio-Rad湿转法转移到PVDF 膜,5%脱脂牛奶封闭1 h,加入5%脱脂牛奶稀释的一抗(1∶1 000 稀释的兔抗人EZH2、鼠抗人ABCG2和鼠抗人GAPDH抗体)在4 ℃孵育过夜,与相应的1∶10 000 稀释的二抗在室温孵育1 h,加ECL 发光剂,用Western Blot化学发光成像系统一体机进行曝光,采用ImageJ2×软件进行吸光度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 EZH2对顺铂IC50的影响

抑制EZH2 蛋白表达后,在HeLa与SiHa细胞中顺铂的IC50 低于对照组;HeLa细胞中过表达EZH2后,IC50高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：A为HeLa-shEZH2细胞活力所占百分比,B为SiHa-shEZH2细胞活力所占百分比,C为HeLa-EZH2细胞活力所占百分比;(1)与对照组比较,P<0.05。

2.2 EZH2对宫颈癌细胞增殖率的影响

4 mg/L顺铂处理72 h后,HeLa-shEZH2组细胞活力率低于对照组;处理48 h后,SiHa-shEZH2组细胞活力率低于对照组;而处理72 h后,HeLa-EZH2组细胞活力率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为HeLa-shEZH2细胞增殖率,B为SiHa-shEZH2细胞增殖率,C为HeLa-EZH2细胞增殖率;(1)与对照组比较,P<0.05。

2.3 EZH2抑制剂GSK343增强过表达细胞对顺铂的敏感性

10 μmol/L GSK343+ HeLa-EZH2组顺铂IC50低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);顺铂处理48 h后,10 μmol/L GSK343+ HeLa-EZH2组细胞活力率低于HeLa-EZH2组。见图3。提示GSK343是一种有效的、选择性EZH2抑制剂。

注：A为GSK343+HeLa-EZH2细胞活力所占百分比,B为GSK343+HeLa-EZH2细胞增殖率;(1)与对照组比较,P <0.05。

2.4 ABCG2和EZH2 mRNA的表达

qRT-PCR结果显示,与对照组比较,抑制EZH2表达后,ABCG2的mRNA水平降低;过表达后其mRNA水平升高;在HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2的mRNA表达均高于对照组;在HeLa-DDP和SiHa-DDP中ABCG2的mRNA表达也高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为改变EZH2细胞表达的宫颈癌细胞中ABCG2 mRNA水平,B为HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2和ABCG2 mRNA水平,GAPDH为内参;与对照组比较,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.5 ABCG2和EZH2蛋白的表达

Western blot结果显示,与对照组比较,抑制EZH2表达后,ABCG2的蛋白水平降低;过表达后其蛋白水平升高; 在HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2和ABCG2的蛋白表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：A、B为改变EZH2细胞表达的宫颈癌细胞中ABCG2 蛋白水平,C、D为HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2和ABCG2蛋白水平;(1)与对照组比较,P <0.01。

3 讨论

宫颈癌是次于肺癌、乳腺癌的第三大女性常见恶性肿瘤,早期以手术治疗为主,有高危因素者术后需补充放化疗;中晚期患者以同步放化疗为主。对于复发性、转移性、难治性宫颈癌患者,化疗是常用的姑息治疗手段,因此化疗在宫颈癌的治疗中越来越重要,然而随着肿瘤化疗耐药性的产生,耐药已经成为导致化疗失败、疾病复发的主要原因。探讨预测宫颈癌化疗敏感性的生物学指标,增强化疗药物敏感性,逆转化疗耐药及靶向治疗将为宫颈癌化疗耐药的治疗提供新的前景[9-12]。研究表明,肿瘤细胞系中EZH2 扩增可导致细胞增殖、迁移和血管生成,并导致肿瘤进展。虽然不同肿瘤中EZH2 的作用方式及机制不同,但是该基因存在往往预示着癌症预后不佳[13-16]。EZH2 作用于抗肿瘤药物敏感基因,可导致肿瘤细胞耐药。在小细胞肺癌中,CDYL/EZH2/CDKN1C 轴促进了小细胞肺癌的化疗耐药,应用EZH2 抑制剂GSK126联合化疗能够一定程度上克服耐药,从而提高患者受益[17]。在肝细胞癌,EZH2-miRNA-IGF1 R 调节轴可能通过改变患者体内miRNA 的变化,改变IGF1 R 的表达,从而介导索拉非尼耐药。应用IGF1 R 抑制剂可显著逆转EZH2 诱导的索拉非尼耐药[18]。顺铂,是一种含铂的细胞非特异性抗癌药物,能与DNA结合,引起交叉联结,从而破坏DNA的功能,并抑制细胞有丝分裂[19]。本研究结果表明,抑制EZH2表达增强宫颈癌细胞对顺铂敏感性而降低其耐药性,表现为顺铂的IC50降低,细胞增殖抑制率显著增加。应用EZH2抑制剂GSK343于过表达EZH2细胞,能够提升细胞对顺铂的敏感性。结果说明EZH2基因参与宫颈癌对顺铂的耐药。为阐明EZH2影响宫颈癌对顺铂耐药的分子机制,接着建立对顺铂耐药的HeLa、SiHa细胞耐药细胞株HeLa-DDP和SiHa-DDP,进一步分析效应分子变化。ABCG2是ABC转运体家族耐药蛋白之一,其功能是将大部可能分的化疗药泵出细胞外,导致细胞内化疗药物浓度降低,参与肿瘤细胞的多药耐药性[20]。研究发现ABCG2与结直肠癌[21]、乳腺癌[22]耐药密切相关。本研究结果显示,抑制EZH2后,ABCG2的mRNA和蛋白表达水平明显降低;过表达后明显升高。HeLa-DDP和SiHa-DDP中EZH2、ABCG2的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,说明EZH2 可能通过调控细胞耐药基因ABCG2诱导人宫颈癌细胞对顺铂的耐药。

综上所述,EZH2基因可能通过调节细胞耐药基因ABCG2的表达而调控着顺铂对宫颈癌化疗的敏感性。而作用的具体机制仍有待于进一步研究,EZH2有望成为宫颈癌化疗耐药的作用靶点。