TGF-β/Smad信号通路及Smad4、p15在结直肠癌中的研究进展

于阳，杨柳，袁喜先

TGF-β/Smad信号通路及Smad4、p15在结直肠癌中的研究进展

于阳1，杨柳1，袁喜先2

1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江佳木斯 154003；2.佳木斯大学附属第一医院消化内科，黑龙江佳木斯 154003

结直肠癌是消化系统常见肿瘤之一，其发病率和病死率较高。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad（small mothers against decapentaplegic）信号通路可调控肿瘤细胞的增殖、分化、浸润、迁移，与结直肠癌的发生发展过程相关。研究表明，Smad4和p15是TGF-β/Smad信号通路的关键效应因子，与肿瘤的侵袭、进展及预后密切相关。本文对TGF-β/Smad信号通路及Smad4、p15在结直肠癌中的最新研究进展进行综述。

结直肠癌；TGF-β/Smad信号通路；Smad4；p15

1 引言

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化系统常见肿瘤之一。2020年全球癌症统计报告显示，CRC的发病率居全球恶性肿瘤第3位，死亡率居全球第2位；而我国CRC的发病率和死亡率均高于世界平均水平[1-2]。CRC的发病较隐匿，早期常无明显临床表现，大多数患者被确诊时已处于中晚期或已出现远处脏器转移，错过最佳治疗时间。恶性肿瘤的发生是较为复杂的过程，常涉及原癌基因的激活及抑癌基因的失活，亦涉及细胞增殖和凋亡的失衡，是多个异常失活、异常表达基因共同作用的结果。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad（small mothers against decapentaplegic）信号通路在CRC的发生发展过程中起促进作用，且与多条信号通路相互作用，对CRC的细胞分化、增殖、凋亡、转移起重要作用[3]。

2 TGF-β/Smad信号通路

TGF-β是多肽类细胞因子超家族，具有多种生物学活性。研究表明，TGF-β在肿瘤初期发挥负性调控作用，可抑制肿瘤细胞的增殖；而在肿瘤末期，TGF-β的过度激活可导致上皮间质细胞增殖、促进血管生成、调节免疫应答、促进肿瘤细胞浸润转移等[4]。TGF-β经典信号通路由TGF-β受体（TGF-β receptor，TGF-βR）Ⅰ和TGF-βRⅡ共同参与；上述两种受体的结构类似，包括由100个氨基酸组成的糖基化的富含二硫键的胞外结构域、一个跨膜区、一个短的近膜序列和一个细胞质激酶结构域；其中细胞质激酶结构域具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性及酪氨酸激酶活性，因此被归为双特异性激酶[5]。游离的TGF-β激活TGF-βRⅡ，从而发生构象改变，TGF-βRⅠ识别并与之结合形成异四聚体复合物；TGF-βRⅠ磷酸化后进一步促进Smad2或Smad3磷酸化，二者与Smad4结合形成异寡聚体，由此产生的Smad复合物由胞浆转位至细胞核；在细胞核中，Smad复合物通过DNA结合蛋白与特异性DNA序列结合，直接或间接调节靶基因的表达，从而调控细胞周期[3]。在正常的细胞周期调控中，细胞周期蛋白激活周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinase，CDK），高度磷酸化的视网膜母细胞瘤Rb基因释放转录因子E2F，启动相关靶基因的表达，细胞周期由G期进展至S期。p21、p16、p15等周期蛋白依赖性激酶抑制因子可直接与细胞周期蛋白/CDK复合物结合，并抑制其表达。TGF-β/Smad信号通路中的任一环节出现异常均可影响细胞周期，导致细胞异常增殖[6]。

3 Smad4

3.1 Smad4的结构与功能

Smad4最初发现于胰腺癌中，在胰腺癌中其又被称为胰腺癌缺失基因4（deleted in pancreatic cancer 4，DPC4）。Smad4是定位于染色体18q21上的抑癌基因，由12个外显子和10个内含子组成，可编码552个氨基酸残基[7]。其N端和C端分别含有2个高度保守的功能区，即Mad同源1（Mad homology 1，MH1）结构域和Mad同源2（Mad homology 2，MH2）结构域。MH1和MH2结构域均可与特异性转录因子相互作用。Smad4 MH2结构域晶体结构分析表明，该分子以同源三聚体的形式存在，可参与DNA的转录激活及核定位。Smad4是介导TGF-β/Smad信号通路应答的关键效应因子。研究表明，Smad4的异常表达使其无法与其他Smad形成异聚体，TGF-β/Smad信号通路传导异常，TGF-β的抑制作用减弱，细胞发生免疫逃逸，从而诱导肿瘤细胞的始动[8]。

3.2 Smad4的异常表达

Smad4是细胞发育和生长调控的多功能调节器，其作为抑癌基因在肿瘤细胞的分化、凋亡、增殖过程中起关键作用[9]。Smad4的失活与其突变和（或）缺失的位置及功能受损相关。

3.2.1 纯合子缺失或杂合子丢失 杂合子丢失（loss of heterozygosity，LOH）通常发生在染色体的5q、18q和17p等位置。在散发性胃肠道肿瘤中可广泛观察到染色体18q处发生LOH、Smad4基因的纯合子缺失或基因内突变。Iacobuzio-Donahue等[10]对63例患者中的70个Smad4/DPC4错义突变基因进行研究，结果发现错义突变76%位于MH2结构域内，18%位于MH1结构域内，只有6%位于接头区域内，表明Smad4/DPC4错义突变在MH2结构域编码区占绝对优势。MH2结构域突变可阻止Smad4的核质易位，导致信号传导中断；MH2结构域的断裂突变可减弱其本身的转录调节功能，致使DNA无法转录[11]。

3.2.2 启动子高甲基化CpG 高甲基化可反映肿瘤调控中发挥作用的基因沉默情况，包括DNA修复、细胞周期调节、促进细胞凋亡或控制与肿瘤相关的关键信号网络[12]。虽然高甲基化相当罕见，但亚硫酸氢盐DNA测序证实，启动子的甲基化状态与Smad4表达缺失存在显著相关性。

3.2.3 Smad4突变导致泛素化增加 越来越多的研究证据表明，泛素化和蛋白酶体降解也与肿瘤衍生的Smad突变体有关，可能诱导肿瘤细胞进展。现已发现，有多种靶向Smad4进行降解的E3泛素-蛋白质连接酶，其具有较高的蛋白质水平，可增加受体和Smad4的降解速率，从而终止信号通路传导[13]。

3.3 Smad4与CRC的发生

在CRC中，Smad4可与多种转录因子、转录激活物及阻遏因子相互作用，通过调节多条信号通路发挥作用，促进肿瘤细胞发育，从而导致CRC的发生[14]。

3.3.1 Smad4与β-连环蛋白（β-catenin） 经典Wnt/β- catenin信号通路在干细胞的生长发育及肿瘤细胞的发育、诱导分化中起决定作用。90%的CRC都与此信号通路相关靶点的突变密切相关。当Wnt/β-catenin信号通路处于失活状态时，胞内由轴抑制蛋白、腺瘤性结肠息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白、酪蛋白激酶及糖原合成酶激酶3β构成的降解复合体可促使游离的β-catenin持续降解，使其在胞内处于较低水平。当Wnt/β-catenin信号通路处于激活状态时，组成胞内复合体的基因会发生突变，导致复合体的结构和功能发生改变，β-catenin无法被降解，在胞内不断稳定积聚，最终向核内转移，从而激活下游靶基因[15]。因此，β-catenin在胞内不断累积并进入细胞核内是其传递下游信号并激活靶基因转录的关键事件。研究发现，Smad4可降低人CRC细胞株SW480中相对荧光素酶活性，表明Smad4与Wnt/β-catenin信号的减少、β-catenin/转录因子靶基因表达的减少及E-钙黏蛋白表达的诱导有关[16]。Freeman等[17]研究发现，CRC患者组织样本中的Smad4水平降低与β-catenin信使RNA水平升高有关，Smad4缺失与β-catenin信使RNA水平的增加及Wnt靶基因表达的增加相关。

3.3.2 Smad4诱导E-钙黏蛋白 E-钙黏蛋白是建立和维持细胞黏附和上皮分化的关键分子。作为肿瘤抑制因子，其功能性下调在肿瘤细胞表达及转移过程中十分重要，涉及细胞间黏附、细胞存活、局部侵袭、内渗和外渗变化[18]。Ioannou等[19]研究发现，Smad4与E-钙黏蛋白转录调控呈负相关，E-钙黏蛋白很有可能是CRC发生中Smad4的靶基因。另外，Smad4可能与肿瘤细胞的淋巴侵袭相关。综上，Smad4被认为是人CRC上皮间质转化的中心成分，其与转录因子结合减少E-钙黏蛋白的表达并改变上皮表型。

3.3.3 Smad4与APC基因 APC基因是Wnt/β-catenin信号通路中的关键因子，是CRC中最常见的突变基因之一。有学者运用减数分裂法构建在同一染色体上携带APC和Smad4两种突变的复合杂合子，在含有APC和Smad4顺式复合杂合子的裸鼠中可观察到广泛的黏膜下浸润及腺癌进展，而单纯APC杂合子息肉则无疾病进展；表明在APC基因缺陷小鼠中，剩余野生型Smad4等位基因的丢失可促进肠息肉向CRC进展[20]。

3.4 Smad4在CRC中的意义

Smad4缺失常为CRC发展的晚期事件。作为晚期事件，Smad4的表达缺失常伴随肿瘤的远处转移，其状态也与肿瘤微环境密切相关。在原位异种移植模型中，Smad4缺陷型CRC细胞可分泌更多的趋化因子CCL9和CCL15，募集CCR1+骨髓细胞，从而促进肿瘤细胞的进一步转移[21]。

Smad4的缺失与恶性肿瘤的复发及其耐药性相关。当Smad4缺失时，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/细胞分裂周期蛋白2/凋亡抑制因子survivin信号通路被激活，通过级联反应可减弱G1/G2细胞周期阻滞，触发5-氟尿嘧啶的化学敏感性，使其无法发挥胸苷酸合成酶抑制剂的作用，对介导细胞凋亡具有耐药性[22]；且在产生耐药性后其对CRC肿瘤细胞的免疫浸润丧失，使其再次复发[23]。Mizuno等[24]研究显示，伴有Smad4低水平的Ⅲ期CRC患者的平均总生存时间为1.7年，而Smad4高水平患者的平均生存时间>9年，Smad4的丢失是其发生不良事件的独立影响因素；另有研究证实，Smad4突变可作为肿瘤不良预后的标志物[25]。

4 p15

4.1 p15的结构及功能

p15位于人染色体9p21上，含有2个外显子，其编码的蛋白属于周期蛋白依赖性激酶抑制因子家族，包含137个氨基酸，分子量为14.7kDa。p15参与细胞周期的调节，与CDK4/6结合，阻止CDK与细胞周期蛋白D的结合，抑制Rb磷酸化，抑制相关基因转录，阻止细胞由G1期进入S期[26]。p15是调控细胞周期、减少细胞异常分化的因子之一，多种肿瘤的发生与p15密切相关。

4.2 p15与Smad4

TGF-β可诱导Smad2、Smad3和Smad4形成异源三聚体复合物，Smad2、Smad4在细胞核内与转录因子Sp1结合并共同激活Sp1的转录活性，Smad3通过间接作用反式激活p15启动子，p15Ink4B启动子可诱导细胞生长停滞，使TGF-β对正常上皮细胞的生长发挥抑制作用。研究证实，在TGF-β信号通路诱导的复合物中，p15的激活须有Smad4参与，这进一步肯定Smad4肿瘤抑制因子的作用。Smad4失活的情况下，TGF-β不能诱导p15Ink4B（或p21）表达，从而无法诱导细胞生长停滞[27]。Rajasekaran等[28]研究发现，细胞周期抑制剂p15Ink4B可作为TGF-β/ Smad4诱导的肿瘤抑制功能的重要靶标。

4.3 p15在CRC中的意义

p15启动子CpG岛甲基化失活在CRC的发生发展中起关键作用。梁晶等[29]研究发现，p15在正常大肠黏膜、腺瘤、癌症序列中表达率逐步递减，大肠癌组织中p15的表达率明显降低，表明大肠癌中p15的阳性表达率与大肠癌的组织分化程度有关，认为p15表达下调为CRC发生的中晚期事件。作为肿瘤抑制基因，p15表达量的高低与肿瘤的发展及预后密切相关。近年来基因治疗逐步进入人们的视野。研究表明长链非编码RNA的过表达可抑制p15表达，从而导致CRC[30]；新型化合物（阿魏酸结合白藜芦醇）能诱导p15的表达，抑制HCT116细胞的增殖[31]。

5 小结与展望

在肿瘤细胞恶变过程中，TGF-β/Smad信号通路起至关重要的作用[32]。CRC的发生机制较为复杂，是多基因、多途径共同作用的结果。Smad4和p15在CRC中起关键作用，且与CRC的其他信号通路相互作用，进一步介导细胞增殖，抑制凋亡。随着研究的不断深入，希望Smad4和p15能为CRC患者带来治愈的希望。

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（2022–11–06）

（2023–07–18）

R735

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.22.030

袁喜先，电子信箱：1590055933@qq.com