全癌标志物：肿瘤免疫治疗疗效评估的新手段

汤佳林

恶性肿瘤，也就是人们所说的的癌症，其显著特征为体内细胞不受控制地持续分裂、增殖和转移。2020年全球新增癌症病例约为1930万例，癌症相关死亡人数约1000万，其中中国新增癌症病例约为457万例，癌症死亡人数约300万[1]。恶性肿瘤发病率和死亡率逐年升高，已成为人类面临的全球性的公共卫生挑战。

肿瘤免疫治疗及其疗效评估现状

传统肿瘤治疗方法包括外科手术、放射治疗、化学药物治疗等，但这些方法都存在一定的缺陷，如：外科手术风险高、创伤大，且术后可能产生一系列并发症，影响预后和后期治疗；放射治疗过程中，随着累积剂量的增加，当超过正常组织的耐受剂量时，会导致机体功能紊乱失调，皮肤瘙痒糜烂等放射损伤，影响组织正常功能；传统的化学药物治疗，因其对正常细胞生长增殖的影响会引起恶心呕吐、感染、脱发等不良反应。因此，研究人员越来越多地将目光投注在免疫治疗领域。

免疫治疗已有100多年的历史，早在19世纪末，科利（W. Coley）就采用混合的细菌毒素（也称为科利毒素）来治疗恶性肿瘤，这是肿瘤免疫治疗的起步。但是直到近十年，免疫治疗才逐渐走入大众视野，并受到世界肿瘤学界的广泛认可。2013年《科学》（Science）杂志评出的年度十大科学突破排行榜中，免疫治疗高居榜首，成为了癌症免疫疗法历史上的里程碑事件。近年来，随着肿瘤学、免疫学、分子生物学、生物工程等学科的发展，肿瘤免疫治疗已成为继手术和放、化疗之后肿瘤治疗的新模式。免疫治疗是国内外肿瘤治疗研究领域的热点之一，大量临床研究均显示出令人振奋的成果。免疫检查点抑制剂（ICIs）包括程序性细胞死亡1（PD-1）抑制剂、程序性细胞死亡1配体1（PD-L1）抑制剂和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抑制剂已经彻底改变了癌症治疗，并在过去几年中成为多种恶性肿瘤的标准治疗方法，为晚期黑色素瘤和非小细胞肺癌、膀胱癌等实体瘤患者带来了福音[2，3]。

肿瘤免疫治疗的出现，显著提高了肿瘤患者的生存质量，然而，如何选择有效的免疫治疗药物却成了医生和患者的一个难题。不同类型的药物，治疗反应不尽相同，原本基于影像学为主的疗效评估手段已经无法适应抗肿瘤药物日新月异的变化，急需有效的动态评估抗肿瘤治疗的措施。1979年，世界卫生组织（WHO）定义了肿瘤疗效评估的方法，该标准明确了实体瘤双径测量的疗效评价标准，即测量所有肿瘤的最大平面范围并将所有值相加，比较两次检查间的所有肿瘤平面最大值之和。1985年，相关研究发现临床试验疗效评价的偏倚有5%～10%，是因为WHO标准对有些病灶的定义模糊和肿瘤测量上的误差造成的，这显然会降低评估结果的可比性，从而影响结论的可靠性。1999年，研究者提出了以肿瘤最长径的长度代替面积来代表肿瘤大小的一维测量方法（或称单径测量法）[4]，并于2000年发布了RECIST 1.0标准，2009年RECIST标准更新为1.1版本。这些标准虽然在WHO标准的基础上简化了测量步骤，提升了准确性，但仍然是根据传统影像（CT、MR）测量肿瘤大小的变化来判断疗效。实际上，许多肿瘤治疗后在体积上的变化并不明显，例如淋巴瘤、肉瘤、肝癌等。因此，用RECIST标准并不能很好反映真实的疗效。

2017年，RECIST工作组及其免疫治疗小组委员会发表了《实体瘤免疫疗效评价标准（iRECIST）》，阐述如何评价免疫治疗试验中的缓解和进展[5]。iRECIST这一新分类是基于近年来肿瘤免疫治疗临床研究的结果，即使在治疗开始时出现一些新发病灶，或总肿瘤负荷未显著增加，之后仍可能发生肿瘤消退或稳定。这是免疫相较于既往化疗和靶向药物治疗的差异之一，也革新了有关免疫治疗肿瘤负荷的评价标准。然而，随着免疫治疗时代的到来，出现了很多以前在肿瘤评价方面未曾出现的难题，比如假性进展、新发病灶，这些新出现的现象，是免疫治疗本身所带来的，其本质是机体激活的免疫细胞对肿瘤的一种攻击反应，它是提示肿瘤治疗有效的一种标志。但如果按照iRECIST标准进行判断，则会判定为肿瘤进展，这样会对患者下一步的临床治疗带来一定的影响。

DNA甲基化为什么能作为疗效评估的手段

液体活检是一种便捷、非侵入性的检测方法，可多次取材、实时反映肿瘤异质性的变化，为肿瘤的个性化诊疗提供参考依据。肿瘤患者体内的循环游离DNA（circulating free DNA， cfDNA）除正常细胞来源外，还有凋亡肿瘤细胞释放到血液中的DNA小片段，即循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）。ctDNA是一种微创生物标志物，可以帮助测量多种情况下的疾病状态，包括治疗后为检测分子残留疾病而进行的手术或治疗（MRD），在监测期间和整个治疗过程中能做到动态、实时反应肿瘤的治疗变化情况，且样本容易获得，无需手术，来自肿瘤细胞的ctDNA存在于患者血液、滑膜液等各种体液中，且血液中的ctDNA能全面反映肿瘤血液负荷情况，能克服肿瘤组织样本取样的异质性，并可以重复检测，持续追踪肿瘤演变过程。

DNA 不是遗传信息的全部，DNA 上的一些修饰，比如 DNA 甲基化，也會影响这个基因的表达，如果这个基因正好是癌症相关基因，那么 DNA甲基化这种修饰可能就有诱发癌症的风险，故DNA甲基化是癌症发病和进展过程中基因表达和组织分化的重要表观遗传调节因子，过去几十年里在多种癌症中得到了深入研究。cfDNA中的甲基化异常是液体活检样本中研究最广泛的标志物之一。目前cfDNA 甲基化作为癌症检测生物标志物的效用已经得到了临床评估，例如 FDA批准的Epi proColon（Epigenomics AG）试剂盒，可以检测血浆 cfDNA 中的高甲基化SEPT9，专门用于结直肠癌筛查[6]。DNA甲基化与各种恶性肿瘤的发生、发展和死亡密切相关，如胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等[7，8]。除此之外，探索多种肿瘤的DNA甲基化标志物在研究领域也受到了关注。

DNA甲基化有其特有的优势。首先，与现有的组织细胞形态学、蛋白检测及传统的肿瘤标志物不同，DNA甲基化异常发生于肿瘤发生的更早期，可以更早预测肿瘤。其次，发生甲基化变化的CG位点往往在基因组的同一区域内成簇分布，更容易检测；同时，肿瘤发生各阶段都伴有诸多基因的甲基化变异，潜在标志物数量更多、更灵敏。最后，DNA甲基化更稳定，可以在多种不同的临床样本类型中进行检测，例如血浆样本、病理切片样本等。基于DNA甲基化的肿瘤检测，可应用于肿瘤的超早期筛查、辅助诊断、疗效评估、复发监测等覆盖肿瘤诊疗的全流程，是目前肿瘤筛查与分子诊断领域最热门的检测方法之一，因此，对血液中ctDNA的甲基化检测可以作为免疫治疗疗效评估的有效手段。

现有DNA甲基化标志物在疗效评估中的不足

DNA甲基化与癌症发生发展的相关性，为个体化治疗方案的选择和疗效评估提供了新思路，展现了良好的应用前景。尽管 DNA 甲基化可用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效预测、预后判断等，但是其应用还存在一些挑战。首先，针对不同的癌症类型，往往有不同的肿瘤标志物；换而言之，如果我们想要做全身的检查，需要检测多个标志物。其次，哪怕对于特定的肿瘤，通常需要多个甲基化标志物的联合检测，有时候甚至需要依赖于一些复杂的算法。另外，目前的甲基化检测主要依赖于焦磷酸测序或高通量测序（NGS），兩者均需要价格昂贵的仪器，这些问题限制了甲基化标志物的现实应用。

目前在临床上DNA甲基化肿瘤标志物分为两大类：单癌种标志物和泛癌种标志物，其中比较热门的是泛癌种标志物。两者都强调肿瘤的异质性，不同点在于单癌种标志物是指一个肿瘤标志物检测一个癌种，是“一对一”的关系，而泛癌种标志物是把多个不同肿瘤标志物组合成一个集合，实现多个肿瘤的检测，是“多对多”的关系。这两大类DNA甲基化肿瘤标志物在一定程度上改善了恶性肿瘤疗效评估的问题，然而，单癌种甲基化检测的灵敏度和特异性都相对比较高，但一个标志物只能检测一个癌种，随着检测癌种数量的增加，费用也会增加，而泛癌种早筛检测的灵敏度和特异性会随着检测癌种的增加，而不定量降低。

现有DNA甲基化标志物存在较大的局限性，一方面，标志物的特异性不佳，经常让患者全身检查了一遍发现是虚惊一场；另一方面，不足以反映所有癌症类型共有的表观遗传特征，癌症早期筛查漏诊率高，即使像Galleri这样从事肿瘤早筛的公司，它公布的基于NGS技术的泛癌早筛临床验证数据显示，临床Ⅰ期肿瘤的检出率只有16.8%，Ⅱ期肿瘤也仅有40.4%。这样的检出率非常低，远远不能满足大众对于肿瘤早检的需求，因为可能有70%～80%的肿瘤在其早期检测不出来，这也就意味着这些DNA甲基化标志物在疗效评估中发挥的作用是极其有限的。

全癌标志物在疗效评估中具有重要的临床应用潜力

不同肿瘤具有异质性，同样也具有共性，能否找到不同肿瘤共有的甲基化标志物，从而将它们一网打尽呢？基因甲基化与肿瘤相关，基因组中甲基化的CG位点有大约2800万，要检测DNA甲基化的状态，就必须覆盖足够多的CG位点。既往的甲基化检测方法，比如芯片，只能观察到1%的甲基化状态，如同摸象只探其尾。全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）是目前DNA甲基化测序的金标准，但其方法存在固有缺陷，对肿瘤细胞DNA中胞嘧啶的覆盖率只有50%左右，因WGBS通过重亚硫酸盐处理DNA来构建WGBS文库，而重亚硫酸盐易导致DNA片段的断裂，同时将大量未甲基化的胞嘧啶变成胸腺嘧啶，从而使基因组的复杂度降低，DNA甲基化检测片段与标准基因组的比对率下降，导致测序结果不准确。

为突破传统 DNA 甲基化测序方法中比对率低的瓶颈，找到不同癌症共有的甲基化标志物，全癌标志物研究联盟经过 8 年的攻关开发了导航定位测序（GPS）方法[9]，借助双端测序，即测序的一端是基因组原序列，另一端是经过重亚硫酸盐处理后的表观序列，彻底解决了匹配率低的问题，找到了在所有癌症中共有的DNA甲基化标志物，命名其为全癌标志物（universal cancer only marker， UCOM）。 2019 年发表了第一个全癌标志物HIST1H4F [10]；2021年，他们发表了第二个全癌标志物 PCDHGB7 [11]；2022年，该团队联合空军军医大学附属西京医院等机构，成功鉴定了又一个全癌标志物——高甲基化SIX6 [12]。

全癌标志物可在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌等疾病的早期检测、转移风险预测、辅助手术切沿判断等多个临床场景中应用[10-12]，不仅在临床诊断中有非常好的效果，其在伴随诊断中也有优秀的表现。目前所有的肿瘤治疗方案，无论是化疗放疗还是免疫治疗，如果临床诊疗措施能够杀死肿瘤细胞，肿瘤细胞的DNA就会释放入血，这时DNA甲基化检测就会出现峰值，从而有利于疗效的判断。与上海第九人民医院进行的PD-1治疗的疗效评估中，研究人员发现全癌标志物不仅能帮助判断患者适用哪种治疗方案，还可以让患者知道自己用哪个厂家的 PD-1治疗效果更好。全癌标志物结合肿瘤的免疫治疗疗效分析，将为今后肿瘤的精准化治疗提供理论依据。

结 语

继“人类基因组计划”之后，又一项意义重大的项目“精准医疗”开始启动，人类步入精准医疗时代，肿瘤治疗成为精准医疗的短期目标，随着精准医学的大力发展，肿瘤免疫治疗也逐渐深入临床并被广泛应用，为患者带来明显的生存获益，也为精准医疗飞速发展提供了助力。使用“液体活检”血浆开发新方法来评估治疗反应以及抵抗可能的耐药性是精准医疗的重点研究内容之一，全癌标志物的发现将DNA甲基化在肿瘤检测中的应用推进到一个崭新的阶段，在肿瘤免疫治疗的疗效评估中具有重大的应用潜力。

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[11]Dong S， Lu Q， Xu P， et al. Hypermethylated PCDHGB7 as a universal cancer only marker and its application in early cervical cancer screening. Clin Transl Med， 2021， 11（6）： e457.

[12]Dong S， Yang Z， Xu P， et al. Mutually exclusive epigenetic modification on SIX6 with hypermethylation for precancerous stage and metastasis emergence tracing. Signal Transduct Target Ther， 2022， 7（1）： 208.

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