青蒿素和槲皮素抑制新冠病毒刺突蛋白介导的细胞因子风暴

吴 伟，吴俊汐，纪旭旭，刘 戟，刘 彬，耿福昌

(1.凉山州中西医结合医院彝族医药研究所＆消化内科，四川 西昌 615000；2.好医生药业集团，四川 成都 610000；3.成都中医药大学医学与生命科学学院，四川 成都 610000；4.四川大学华西基础医学与法医学院分子生物学实验室，四川 成都 610041；5.睿美赞科技有限公司，四川 成都 610044)

根据世界卫生组织2023年2月17日提交的最新数据提示，由SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒感染（coronavirus disease-2019，COVID-19）流行已造成全球范围确诊病例感染7.56亿，死亡684多万[1]。当前，SARS-CoV-2已衍生出多种变体，如奥密克戎的系列变体，严重变异，具高度感染风险[2]。目前疫苗能否有效预防这些新变体仍在研究中[3]。基于此，一些国家针对预防和抗击新型冠状病毒感染也将替代疗法纳入了健康指南[4]。天然化合物具广泛生物活性和治疗特性，对新型冠状病毒感染具潜在预防及治疗作用[5]。故而，寻求有效且容易获得的天然化合物作为新型冠状病毒感染的替代和补充药物，可能有助于预防和治疗新型冠状病毒感染。

SARS-CoV-2感染始于病毒S蛋白与细胞表面血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的结合，这导致病毒颗粒的内吞（细胞进入）和病毒内容物的释放，以允许病毒复制[6]。分子对接研究表明，SARS-CoV-2的天然S蛋白还可以直接结合并激活 Toll样受体（Toll like receptor，TLR）[TLR1、TLR4和TLR6]，这将导致核因子（NF）-κB[nuclear factor（NF）-κB，NFKB]通路的激活，从而上调抗病毒和促炎介质的转录[7]。当免疫反应不受控制时，会引发细胞因子风暴，并导致多器官衰竭[8]。这种激烈的炎性程度与新冠肺炎和肺损伤的严重程度以及高死亡率密切相关[9-11]。因此，阻断S蛋白介导的SARSCoV-2细胞进入对预防SARS-CoV-2感染至关重要，改善S蛋白介介导的细胞因子风暴被认为是预防新冠肺炎发展到更严重阶段的关键治疗方法。

据古籍记载，中国有一种古老的彝族医药防疫药方。该方是彝族医药采用熏蒸法防治流行性传染病的有效措施，至今仍经常使用。青蒿和侧柏叶是这一古老方剂的主要两种药材。体外研究表明，青蒿热水提取物在体外对SARS-Cov-2变体显示出强大的活性[12]。网络、GO和KEGG分析表明，青蒿通过调节炎症反应、增殖、分化和凋亡来应对新冠肺炎[13]。基于网络的数据库分析表明，侧柏叶通过增强个人免疫力来管理和缓解呼吸道病毒感染，包括新冠肺炎[14]。

青蒿素和槲皮素是分别存在于青蒿和侧柏中的主要生物活性化合物[15-16]。青蒿素在VeroE6细胞中测定的预处理或后处理抗SARS-CoV-2测定中显示出优异的效果（选择性指数分别为35或54）[17]。槲皮素在VeroE6细胞中测定的抗SARS-CoV-2测定中也显示出良好的效果（选择性指数=39.81）[18]。因此，青蒿素和槲皮素作为彝族医药古代防疫方剂中的主要生物活性成分，单独或联合使用这两种化合物都可能有效预防和治疗新冠肺炎。

基于上述背景，我们的研究旨在调查：青蒿素和槲皮素单用或联合使用是否可以通过抑制S新冠病毒刺突蛋白介导的细胞因子风暴来改善新冠肺炎。

1 材料和方法

1.1 Venn分析和富集分析 首先，将COVID-19、青蒿素和槲皮素分别输入CTD数据库，下载基因集。分别在这些基因组之间进行Venn分析。其次，交叉部分的基因集被上传到DAVID生物信息数据库、PANTHER数据库、GO（基因本体）数据库、KEGG数据库、Reactome数据库和字符串数据库。然后，对这些交叉基因进行富集分析，以评估这些基因对生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞成分（CC）和信号通路的影响。

1.2 细胞、药品和试剂 Vero细胞来自四川大学生物化学和分子生物学实验室。将细胞保存在补充有10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）中，并在 37℃下用5% CO2孵育。胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）、Dulbecco's改良 Eagle（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）培养基和磷酸盐缓冲盐水（phosphate-buffered saline，PBS）购自 Gibco（Grand Island，NY，USA）。 吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium，PDTC）、青蒿素和檞皮素从Solarbio获得。Ebselen是从Beyotime购买的。

1.3 细胞培养 将含有1 mL Vero E6细胞悬液冻存管在37℃水浴中快速摇晃解冻，加4 mL含10% FBS的DMEM培养基混合均匀；在1 000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，加1～2 mL培养基后用枪轻轻吹打混匀；将Vero E6细胞接种至细胞培养板，在37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养过夜；Vero E6细胞密度达80%～90%，即可进行传代培养。

1.4 细胞活力测定 将细胞以适宜密度接种到96孔板内培养至细胞密度达到约70%～90%；吸出96孔板孔内的培养基，加入适量PBS清洗细胞；而后使用无血清DMEM培养基和CCK8溶液配置反应液（比例为10∶1），混合均匀后，每孔加入100 μL反应液，并设置空白未铺细胞对照孔加入100 μL反应液，放置于37℃和5% CO2恒温箱内孵育1 h；在450 nm处测量吸光度。

1.5 NFKB p65转录活性测定 HEK293T-hACE2细胞用青蒿素、檞皮素、青蒿素+檞皮素或NFKB抑制剂PDTC预处理6 h，然后与SARS-CoV-2 S蛋白孵育18 h。用NFKB p65转录因子试剂盒分析核细胞部分的NK-κB转录因子活化。使用细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒制备细胞质和核细胞级分。通过BCA蛋白质测定法测定蛋白质浓度。将0～2 μg核提取物在涂有NFKB p65共有序列的孔中孵育1 h。第一次孵育后，洗涤孔并与NFKB p65的特异性一级抗体孵育1 h。与一级抗体孵育后，洗涤孔并与HRP缀合的二级抗体孵孵育1 h，然后洗涤。向孔中加入化学发光工作溶液，并使用光度计检测所得信号。据报道，活性NFKB转录因子为每μg蛋白质的化学发光。

1.6 使用ELISA试剂盒评估IL-1β、IL-18、IL-6和IL-8 如上（NFKB p65转录活性测定）所述处理HEK293T-hACE2细胞。收集培养上清液并以3 000 rpm离心20 min。根据说明完成试剂制备。将100 μL样品稀释剂、连续稀释的标准品和测试样品作为零孔、标准孔和测试样品孔添加到微量滴定板中，并在37℃下孵育2 h。洗涤后，加入检测抗体并在37℃下孵育1 h。与抗体孵育后，洗涤孔并与HRP缀合的二级抗体孵育40 min，然后洗涤。加入100 μL显色溶液，在37℃的黑暗中显色15～20 min后加入停止溶液，并使用波长为450 nm的微板读数仪测量OD值。数据分析：需要从零井的OD值中减去每个标准和样品的OD值。以标准产品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，进行四参数拟合。根据样品的OD值，根据标准曲线计算拟合浓度，并乘以稀释系数，以获得样品的测量浓度。

1.7 统计分析 结果以平均值±SD表示。Graphpad Prism 7.0软件用于分析数据。通过Student的非配对t检验比较两组之间的差异。通过单因素方差分析和事后Tukey检验分析不同组间的多重比较。P值小于0.05，被认为是显著的。

2 结果

2.1 Venn分析和富集分析 来自Gene或Pubchem数据库的结果显示，与新冠肺炎、青蒿素和槲皮素相关的基因集中，经智人过滤的基因数分别为9 889、30和4 149。Venn分析结果如表1和图1所示。对基因集1和基因集2、3或4之间的交叉基因进行GO术语富集和通路富集分析的结果如下：1.新冠肺炎和青蒿素（24 BP，18 MF，0 CC，75 KEGG 途径和 95 REACTOME通路），2.新冠肺炎和槲皮素（782 BP、139 MF、128 CC、208 KEGG 通路和 444 REACTOME通路），3.新冠肺炎和青蒿素+槲皮素（787 BP、145 MF、128 CC、208 KEGG 通路和 444 REACTOME 通路）。根据研究方向，筛选出富集分析结果中的重要相关项目（涉及炎症和冠状病毒病-COVID-19等），并显示在表2-7中。

图1 新冠肺炎和青蒿素+槲皮素之间两组基因的维恩图

表1 Venn分析

表2 新冠肺炎与青蒿素交叉基因的GO富集分析

表3 新冠肺炎与槲皮素交叉基因的GO富集分析

表4 新冠肺炎与青蒿素+槲皮素交叉基因的GO富集分析

表5 新冠肺炎与青蒿素交叉基因的通路富集分析

表6 新冠肺炎与槲皮素交叉基因的通路富集分析

表7 新冠肺炎与青蒿素+槲皮素交叉基因的通路富集分析

2.2 青蒿素或槲皮素对Vero E6或HEK293-ACE2细胞的细胞毒性 细胞毒性试验结果表明：用浓度≤100 μM的青蒿素或槲皮素分别处理Vero E6或HEK293-ACE2细胞24 h，不会导致 Vero E6和HEK293-ACE2细胞活力显著性降低（P＞0.05）（如图2所示）。

图2 青蒿素或槲皮素对Vero E6和HEK293-ACE2细胞活力的影响

2.3 SARS-CoV-2S蛋白通过介导NFKB的过度激活诱导细胞因子风暴 基于图3所示的数据，对结果的解释如下：1）S蛋白可以通过以浓度依赖性方式介导NFKB的过度激活而显著诱导细胞因子风暴（aP<0.05）；2）NFKB抑制剂PDTC通过抑制S蛋白介导的NFKB的过激活而显著逆转细胞因子风暴（bP<0.05）。

图3 SARS-CoV-2S蛋白通过介导NFKB的过度激活而诱导细胞因子风暴

2.4 青蒿素和槲皮素对SARS-CoV-2S蛋白介导的NFKB过度激活引发的细胞因子风暴的逆转作用

如图4和图5所示，结果如下：1）S蛋白显著诱导NFKB的过度激活以介导细胞因子风暴（aP<0.05）；2）青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）单独或联合治疗通过抑制由S蛋白介导的NFKB的过度激活显著改善了细胞因子风暴（bP<0.05）；3）青蒿素（15μM）和槲皮素（15 μM）联合治疗显示出比单独治疗更好的改善效果（cP<0.05）；4）NFKB抑制剂PDTC显示出比单独青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）更有效的改善效果（dP<0.05）；5）与 PDTC 相比，青蒿素（15 μM）与槲皮素（15 μM）的联合治疗显示出类似的改善效果（eP＞0.05）。

图4 青蒿素（15 μM）和槲皮素（15 μM）单独或联合治疗对S蛋白介导的NFKB过度激活的抑制作用

图5 青蒿素和槲皮素联合治疗对刺突糖蛋白介导的炎性细胞因子风暴的逆转作用

3 讨论

早在4 000年前的母系社会，彝族的医疗活动已经进行了很长时间[17]。彝族的祖先积累了大量的医学知识，包括针灸、药酒和草药，为进一步研究中国少数民族的医学奠定了宝贵的基础[17]。民族药物研究对于预防未来毁灭性的流行病紧急情况非常重要[18]。

自2019年以来，由SAS-CoV-2引起的新冠肺炎疫情对全球健康产生了深远影响[19]。直到今天，青蒿和侧柏叶一直被彝族用来治疗咳嗽、肺病和呼吸道传染病。本研究证明，青蒿素（浓度≤100 μM）或槲皮素（浓度≤100 μM）对Vero E6和HEK293-ACE2细胞没有细胞毒性（图2）。这与先前的研究结果一致，即青蒿素和槲皮素对Vero E6细胞的CC50分别为3.32 mM和29.1 mM[20-21]。根据本研究中的富集分析，可以推测青蒿素、槲皮素或青蒿素+槲皮素可能通过影响病毒介导的炎性反应来防治新冠肺炎（表2-7）。这些预测需要进一步的实验来证实。

SARS-CoV-2病毒感染可在体内引发复杂的信号级联反应并刺激NFKB，NFKB可诱导炎性细胞因子的转录，并增加 IL-1β、IFN-γ、IP-10、MCP-1、IL-4和IL-1057的分泌[22]。特别是TLR4最可能参与识别SARS-CoV-2的分子模式，以诱导炎症反应[23]。SARS-CoV-2感染后，宿主的炎性细胞因子风暴通常可能在不受控制的免疫反应下启动，失控的炎症反应可能是SARS-CoV-2感染死亡的主要原因[24]。细胞因子风暴会通过免疫系统触发宿主细胞的损伤，并与疾病严重程度相关，导致多器官衰竭或死亡[25]。该研究证明，刺突蛋白可以通过以浓度依赖的方式介导HEK293T-hACE2细胞中NFKB的过度激活，显著诱导细胞因子风暴（图3）。青蒿素以其抗疟活性而闻名。除了抗疟活性外，青蒿素还具有抗病毒和免疫调节作用。青蒿素可以抑制多种炎症信号通路，如MAPK、PI3K/AKT和NFKB，抑制淋巴细胞活化，增加调节性T细胞的数量，抑制胞质分裂的释放，最终减少炎症损伤[26-28]。槲皮素具有良好的抗炎和抗病毒作用，可显著减少IL-6、IL-1β、IL-8和 TNF-α46的分泌[29]。这两种化合物在新型冠状病毒肺炎中都有一定的应用潜力。该研究证明，青蒿素或槲皮素的单独或联合治疗可以通过抑制刺突蛋白介导的NFKB的过度激活来显著改善细胞因子风暴，联合治疗显示出比单独治疗更好的效果（图4和图5）。这些结果提示，青蒿素或槲皮素的单独或联合治疗可以通过抑制SARS-CoV-2刺突蛋白介导的NFKB的过度激活来有效地改善夸大的炎症反应。

4 小结

总之，本项研究结果表明SARS-CoV-2刺突蛋白会介导细胞因子风暴。在SARS-CoV-2刺突蛋白的刺激下，青蒿素或槲皮素的单独或联合治疗可以通过抑制NFKB的过度激活来显著减轻细胞因子风暴。联合治疗显示出比单独治疗更好的效果。我们的研究为预防和治疗新冠肺炎提供了替代和补充药物的参考。