雪上一枝蒿多糖调控调节性T细胞抑制肝癌肺转移机制的研究

彭 磊，张 霞，左爱学，张建英，李斯文，方肇勤*，万春平*

（1.上海中医药大学基础医学院，上海 201203；2.云南中医药大学，云南 昆明 650021；3.个旧市人民医院，云南 个旧 661000）

雪上一枝蒿（Aconiturn brachypodum Diels，短柄乌头）为毛茛科乌头属植物短柄乌头的干燥块根，性温，味苦、辛，有大毒，功能祛风除湿、消肿止痛、通利关节。云南的东北部、西北部以及四川的西南部是其主要的分布产地，系重要的南药品种之一。雪上一枝蒿具有广泛药理作用，主要活性成分是乌头类生物碱。现代药理学研究已表明，乌头类生物碱具有多种药理作用，如镇痛、抗炎、抗肿瘤等[1-4]。然而目前关于其多糖成分报道较少，利用率较低，在提取过程中多糖成分通常也作为废弃物弃用。课题组前期研究以云南东川产雪上一枝蒿作为原材料，从中提取、分离、纯化出一种雪上一枝蒿的多糖组分XP-10，免疫活性测试实验结果显示XP-10具有显著的免疫调节活性。相关研究成果已取得发明专利（专利号：CN107936130 B，雪上一枝蒿多糖及提取方法以及应用）。鉴此，本研究拟通过构建原发性肝癌肺转移小鼠动物模型，进一步研究雪上一枝蒿多糖XP-10对于原发性肝癌肺转移的抑制作用及其作用机理，为雪上一枝蒿多糖抗肿瘤免疫疗法及南药植物资源的合理开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料 BALB/c小鼠，雄性，7～8周龄，体质量18～20 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK2017-0004。饲养条件：SPF级动物房，恒温（22±1）℃，恒湿（55±5）%，饲料、饮水均消毒，自由摄取。实验动物进行1周以上适应性饲养后使用。严格按照实验动物相关管理条例进行所有动物实验。

雪上一枝蒿多糖XP-10由左爱学博士（云南中医药大学中药学院）提供，该化合物性状：焦糖色固体，纯度＞75%，易溶于水，具有黏性。二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）和噻唑兰（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）均购自美国 Sigma公司；Anti-CD3抗体、Anti-Mouse IL-7A-APC、Anti-Mouse Foxp3-Alexa FluorTM488、PEcy7-CD4、Anti-Mouse CD3-APC抗体均购自美国Biolegend公司；RPMI1640培养基购自美国 Gbico公司；青霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司。

H22小鼠肝癌细胞，购自中国科学院昆明动物研究所。

CO2细胞培养箱（Thermo-fisher，美国）、CantoII流式细胞仪（BD，美国）、SpectraMax i3X酶标仪（MD，美国）。

1.2 肝癌肺转移小鼠模型的构建、分组及给药 肝癌肺转移小鼠模型的构建参照文献[5]，采用尾静脉注射肿瘤细胞的方法构建肝癌肺转移小鼠模型。BALB/c小鼠适应性喂养后，用75%乙醇消毒小鼠尾部，尾静脉注射H22腹水瘤细胞悬液，5×105个/只。2 h后，随机分为3组，即：肝癌肺转移病理模型组、XP-10低剂量组（250 mg/kg）和 XP-10高剂量组（500 mg/kg），每组8只。以上各组每天灌胃给药1次，连续11 d，每天记录小鼠的生存状态和体重。

1.3 肺内转移灶数目统计 药物干预后，处死小鼠，取出全肺，剥离肺脏，用 Bouin氏液固定24 h，无水乙醇漂洗至黄色褪去，镜下观察肺内肿瘤情况，以单盲法计数肺转移瘤结节数。

1.4 脾淋巴细胞悬液的制备 小鼠酒精消毒后，取其脾脏，无菌载玻片轻轻研磨，滤膜过滤，离心10 min，小心吸弃上清，在每只样本试管中各加入红细胞裂解液1 mL，混匀，以使红细胞充分裂解，加入1640培养基终止裂解，PBS洗2次，最后加入10% RPMI-1640培养基，并将脾淋巴细胞浓度调至4×105个/mL，备用。

1.5 MTT法检测各组淋巴细胞增殖功能 常规制备各组脾淋巴细胞悬液，按照4×105个/孔接种于96孔板，同时加入2.5 μg/mL丝裂原刀豆蛋白 A（Con A）刺激细胞，放入培养箱中培养48 h，采用MTT法测定各组OD值，以检测脾淋巴细胞的活力。

1.6 流式细胞术检测淋巴细胞表面分子和胞内表达水平 流式细胞术检测参考文献[6]。对淋巴细胞表面分子标志的染色：各组分别取2×106个脾淋巴细胞悬液，1 200 rpm离心5 min，弃上清，封闭FcR，再加入带荧光标记的抗体，室温15 min，进行淋巴细胞表面分子标志染色，FAC冼液清冼1次，收集细胞，完成上机检测。对淋巴细胞内细胞因子的染色：各组分别取2×106个小鼠脾淋巴细胞，加入刺激素PMA、Ionomycin以及阻断剂BFA，放入细胞培养箱中培养4 h，收集细胞，洗液清冼2次，弃上清，封闭FcR，进行淋巴细胞内细胞因子的染色。固定液固定、穿膜液清洗，加入带有荧光标记的抗干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）和白介素 17A（interleukin-17A，IL-17A）抗体。流式细胞仪检测胞内特异性转录因子Foxp3，Flowjo软件进行分析。

1.7 统计学处理 采用SPSS进行数据分析处理，组间差异使用One-Way ANOVA单因素方差分析；若方差不齐，采用LSD法分析；所有实验数据以表示，P<0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有显著统计学差异。

2 结果

2.1 XP-10干预能减少肝癌肺转移模型小鼠的肺转移病灶结节数 体外免疫活性筛选结果提示：XP-10具有显著的免疫增强活性。为进一步评价XP-10体内给药抗肿瘤免疫作用，我们构建了肝癌肺转移小鼠模型。结果显示，与模型组比较，XP-10（250 mg/kg和500 mg/kg）组显著减少肝癌肺转移模型小鼠肺转移病灶结节数，差异均具有统计学意义（P<0.01），结果见图1和表1。结果提示：雪上一枝蒿的多糖组分XP-10对H22原发性肝癌肺转移具有明显抑制作用且疗效显著，预测XP-10的临床应用价值较好，具有开发前景。

图1 XP-10对肝癌肺转移模型小鼠肺转移结节数的影响

表1 XP-10对肝癌肺转移模型小鼠肺转移病灶结节数的影响（±s，n=8)

表1 XP-10对肝癌肺转移模型小鼠肺转移病灶结节数的影响（±s，n=8)

注：与模型组比较，**P<0.01。

组别 剂量（mg/kg） 肿瘤结节（个）模型对照组 - 13.63±4.14 XP-10 250 7.00±2.51**500 6.17±4.40**

2.2 XP-10能促进肝癌肺转移模型小鼠脾淋巴细胞的增殖 采用MTT法测定各组细胞在570 nm的OD值，以检测肝癌肺转移模型小鼠脾淋巴细胞的活力，结果见图2。结果显示：与模型组比较，XP-10低剂量（250 mg/kg）和高剂量（500 mg/kg）组肝癌肺转移模型小鼠的脾淋巴细胞的活力得到显著提高（P<0.01）。结果提示：雪上一枝蒿的多糖组分XP-10可能是通过提高机体的抗肿瘤免疫能力而发挥抑制H22原发性肝癌肺转移的作用。

图2 MTT法检测XP-10对肝癌肺转移模型小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

2.3 XP-10对肝癌肺转移模型小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞的表达无明显影响 在机体的抗肿瘤免疫效应中，T淋巴细胞，尤其是CD4 T细胞亚群起到至关重要的作用，与肿瘤密切相关。采用流式细胞术对XP-10对肝癌肺转移模型小鼠的CD3+、CD4+T淋巴细胞的表达情况进行检测，结果如图3所示：与模型组比较，XP-10低剂量（250 mg/kg）和XP-10高剂量（500 mg/kg）组肝癌肺转移模型小鼠的CD3+、CD4+T淋巴细胞的比例均没有受到明显影响，没有显著变化（P＞0.05）。提示：XP-10主要影响肝癌肺转移模型小鼠T淋巴细胞增殖功能，而对CD3+、CD4+T淋巴细胞表达无明显影响。

图3 流式细胞技术检测XP-10对肝癌肺转移模型小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞表达的影响

2.4 XP-10能够显著下调肝癌肺转移模型小鼠Treg细胞的表达水平 调节性T细胞（Tregulatorycells，Treg）是T细胞的一个亚群，发挥重要的免疫抑制作用，在免疫逃逸、抗肿瘤免疫及诱导免疫耐受等方面起着很重要的作用。采用流式细胞技术进行检测，结果如图4所示：相较于模型组，XP-10两个剂量灌胃组Treg细胞（Foxp3+CD4+T细胞）的表达均出现下调，其中XP-10低剂量（250 mg/kg）给药组差异具有统计学意义P<0.05）。

图4 流式细胞技术检测XP-10对肝癌肺转移模型小鼠Treg细胞表达水平的影响

2.5 XP-10对肝癌肺转移模型小鼠Th1和Th17细胞的表达水平无明显影响 T淋巴细胞作为细胞免疫功能的承担者，在生物体的免疫反应中占据重要地位，同时T淋巴细胞亦是免疫应答的调节者，具有多种生物学功能。其中Th1和Th17细胞在机体抗肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。采用流式细胞技术检测CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+的表达，结果如图5所示：与模型组比较，XP-10干预后，Th1细胞（IFNγ+CD4）和 Th17细胞（IL-17+CD4）表达无显著变化（P＞0.05）。

图5 流式细胞技术检测XP-10对肝癌肺转移模型小鼠Th1、Th17表达水平的影响

3 讨论

肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，死亡率高，在常见消化道肿瘤中排名第3[7]。肝癌也是最难治的恶性肿瘤之一，其难治性表现除恶性程度高，起病隐匿，病情进展快等常见恶肿瘤特征外，主要还体现于其高复发性和高转移性。肺部器官中血管和淋巴管丰富，因此肺是最常见的肝外转移器官，占肝外转移的39.5%～53.8%，一旦发生肺转移则治疗棘手，严重影响患者预后，死亡率高[8]。目前西医临床尚无可靠的肝癌肺转移防治方法。大量研究已表明，中医药在对抗化疗诱导的副作用、增效减毒和防复发转移等方面具有独特优势。热毒、瘀毒证候是肝癌中医学临床基本证候之一，毒邪致病峻烈、顽固、易相兼为病，临床治疗集中体现为其难治性。研究雪上一枝蒿多糖对于肝癌肺转移的作用及机制可在一定程度上丰富肝癌中医证候、治法方药等方面的理论依据与科学证据。

为评价雪上一枝蒿的多糖组分XP-10对肝癌肺转移的影响，我们通过小鼠尾静脉注射H22肝腹水瘤细胞成功构建肺转移肿瘤动物模型，造模后可见模型小鼠肺上肿瘤结节，体现H22腹水瘤细胞在体内的转移情况。该方法造模简单，成模率高，是评价肝癌肺转移模型经典模型[3]。从研究结果来看，使用雪上一枝蒿多糖组分XP-10对肝癌肺转移模型小鼠进行药物干预，能显著减少肝癌肺转移的病灶结节数。结果提示：XP-10能够针对H22原发性肝癌肺转移起到显著疗效。肿瘤的发生与转归与机体的免疫功能密切相关，MTT法检测淋巴细胞增殖功能显示，XP-10灌胃给药显著激活模型小鼠脾淋巴细胞的增殖反应，提示XP-10具有显著抗肝癌肺转移效应，其作用机制与提高荷瘤小鼠抗肿瘤免疫效应有关。

T淋巴细胞在机体的抗肿瘤免疫反应中发挥着至关重要的作用。在不同刺激因素的作用下，CD4+T细胞能够进一步分化为Th1、Th17、Treg等功能性T细胞亚群，从而诱导产生不同的免疫效应，在机体的免疫反应中发挥不同的功能。Th1细胞亚群主要在细胞因子IFN-γ+与IL-12条件下分化，介导机体的细胞免疫反应。Th17主要分泌细胞因子IL-17，其主要功能是介导机体的炎性反应（防御胞外病原菌的感染），具有高致病性[9]。Treg细胞主要通过分泌免疫抑制因子IL-10和TGF-β发挥免疫负调节作用，其主要功能介导机体免疫耐受和维持内环境的稳定性[10]。大量的研究已表明，这些CD4+T细胞亚群之间的平衡与抗肿瘤免疫反应息息相关。流式细胞技术检测结果显示，雪上一枝蒿多糖组分XP-10能显著下调肝癌肺转移模型小鼠调节性 T细胞（CD4+Foxp3+Treg细胞），然而对介导炎症反应Th17细胞（CD4+IL-17A+T细胞）和Th1细胞（CD4+IFN-γ+T细胞）免疫反应无明显的影响。在肝肿瘤组织和肝转移癌中，CD4+Foxp3+调节性T细胞大量聚集肿瘤微环境，这些Treg细胞被特异激活，高表达GITR和 ICOS，抑制肿瘤特异性CD4+T细胞的反应，这些结果表明肿瘤相关性Treg细胞与肿瘤逃逸和转移密切相关[11-12]。雪上一枝蒿多糖组分XP-10可能通过抑制Treg细胞的表达这一途径来诱导机体的免疫效应，从而起到抑制肝癌肺转移的作用。该研究为我国具有自主知识产权中药组分-雪上一枝蒿多糖XP-10治疗肝癌转移提供了一定科学基础。