角膜基质修复的机制和调控因素研究进展

程思敏,杨燕宁

0 引言

角膜是透明、无血管、神经密集的重要屈光结构,分为上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮层,其中基质层对角膜透明度的维持具有重要作用[1]。外伤、感染、手术、遗传和全身疾病等因素导致基质结构改变,轻度损伤后出现角膜混浊通过基质修复可减退,严重损伤后发生角膜基质纤维化,形成角膜瘢痕会降低角膜透明度,影响视力[2-3]。角膜混浊或角膜瘢痕引起的视力障碍是全球致盲的主要原因,影响超过1 000万人[4]。目前,临床上角膜移植手术是角膜瘢痕患者恢复角膜功能和视力的主要治疗手段,但其效果因角膜供体资源短缺、手术技巧要求和术后移植排斥风险存在限制[5]。角膜基质占角膜厚度的90%,由基质细胞和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)组成[6]。角膜基质细胞可分泌胶原蛋白、蛋白多糖和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)等,具有合成、组装ECM和防御的功能[7]。ECM由蛋白聚糖和胶原纤维组成,具有维持角膜形状、硬度和透明度的功能。蛋白聚糖调节胶原纤维形成和排列,胶原纤维规则排列产生最小的光散射从而维持透明度[8]。角膜基质细胞及ECM结构和功能正常是维持角膜透明度的必要条件。因此,深入研究角膜基质损伤修复的机制对于维持角膜透明度具有重要意义,本文就角膜基质损伤修复的机制及其调控因素进行综述。

1 角膜基质损伤修复的机制

角膜基质修复是一个复杂而有序的过程,涉及细胞凋亡、增殖、分化和迁移,细胞因子分泌和分子信号传导等相互作用。角膜基质受损后,生长因子激活角膜肌成纤维细胞(corneal myofibroblast, CMF)形成,ECM与胶原蛋白相互作用促进基质重塑,免疫细胞迁移至损失部位驱动角膜基质修复[1]。严重角膜损伤后,角膜上皮基底膜(epithelial basement membrane, EBM)不完全再生,肌成纤维细胞持续存在引起基质纤维化,角膜透明度下降[9]。

1.1 角膜基质细胞表型转变上皮-基质、基质-基质的相互作用促进基质细胞表型改变,对基质伤口愈合发挥关键作用。基质细胞凋亡是基质修复的始动环节。受损的角膜上皮细胞分泌白细胞介素1(interleukin 1, IL-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、转化生长因子β(transforming growth factor β, TGF-β)等细胞因子进入角膜基质[1]。损伤区IL-1水平升高,激活Fas/Fas配体系统引起基质细胞迅速凋亡,邻近基质细胞增殖、迁移并填补伤口[10]。基质细胞活化标志基质进入修复阶段。TGF-β、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)刺激基质细胞活化形成成纤维细胞,并向受损区迁移、取代凋亡细胞和分泌MMP和胶原蛋白酶参与ECM合成和降解,细胞内角膜晶状体蛋白和硫酸角质素蛋白聚糖表达降低从而引起角膜混浊[11]。角膜成纤维细胞分化为CMF是基质重塑的关键途径。TGF-β刺激成纤维细胞分化形成CMF,特异性表达平滑肌肌动蛋白α(alpha-smooth muscle actin, α-SMA),收缩伤口、分泌ECM、使周围基质具有黏附能力[12]。CMF大部分来源于成纤维细胞,部分由巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等骨髓衍生细胞(bone marrow derived cells, BMDC)发育而来,IL-1和TNF-α刺激BMDC从角膜缘血管进入角膜基质,TGF-β诱导其转化为CMF[13]。随着角膜EBM再生,上皮细胞分泌的TGF-β进入基质减少,CMF凋亡,基质完成修复和再生[14]。当CMF过度发育,分泌大量无序的ECM沉积在基质中,基质纤维化形成角膜瘢痕[15]。

1.2ECM重塑ECM重塑是恢复角膜透明度的重要过程。角膜基质细胞凋亡、炎症因子和纤维化因子分泌(IL-1、TNF-α、单核细胞趋化因子1)、非基质成分的细胞暂时出现(中性粒细胞、巨噬细胞、CMF)和细胞活化产生ECM降解酶等共同参与ECM重塑[16]。角膜基质损伤后,成纤维细胞分泌胶原蛋白酶,参与ECM降解;CMF分泌纤维黏连蛋白、蛋白聚糖和透明质酸组成临时基质,参与ECM合成和组装[1]。同时,蛋白聚糖调节胶原纤维生长并促进ECM组装[17]。此外,ECM合成和组装过程中可形成异常蛋白质,如Ⅲ、Ⅷ、XⅣ和XⅧ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白角膜缘亚型、胚胎纤连蛋白亚型、血小板反应蛋白1、肌腱蛋白C和原纤维蛋白1等,这些蛋白在正常成人角膜基质中很少或基本不存在[16,18]。严重损伤后,由于ECM蛋白代谢和更新缓慢,异常蛋白长期沉积在基质中,形成角膜瘢痕、降低角膜透明度从而影响视力[19]。

1.3 免疫细胞迁移免疫细胞的迁移参与角膜基质修复。中性粒细胞是免疫反应发生的效应细胞,肥大细胞、巨噬细胞、γδT淋巴细胞、朗格汉斯细胞等免疫细胞发挥固有免疫的作用[20]。上皮细胞释放细胞因子激活树突状细胞,吸引中性粒细胞和γδT淋巴细胞向伤口部位迁移[21]。角膜损伤早期,角膜缘中的肥大细胞脱颗粒,分泌细胞因子、趋化因子和生长因子促进炎症,如趋化因子2引起中性粒细胞募集[22-23]。角膜成纤维细胞分泌单核细胞趋化因子1刺激角膜缘或循环中免疫细胞迁向基质损伤区迁移,清除凋亡的基质细胞[24]。此外,巨噬细胞在角膜修复和再生发挥重要作用。基质修复早期,巨噬细胞激活分泌IL-1β、TNF-α,引起基质炎症。基质修复后期,中性粒细胞募集激活巨噬细胞迁移进入损伤区,分泌MMP2促进角膜修复[25]。基质损伤刺激BMDC进入角膜基质转化成CMF,当巨噬细胞的耗竭会引起CMF减少,影响基质伤口愈合[13,26]。随着基质修复和伤口愈合,免疫炎症细胞逐渐减少,当免疫细胞持续浸润,角膜基质纤维化从而引起角膜混浊。

2 角膜损伤因素对角膜基质损伤修复的调控

2.1 创伤外伤、手术导致的创口的形态和损伤程度影响基质修复。外伤产生平行与角膜表面的伤口一般形成细小瘢痕,引起CMF的修复和基底膜的再生,经过1a或更多的时间可完全修复。而垂直与角膜表面的伤口或裂开的伤口会引起胶原蛋白和蛋白聚糖沉积,形成的瘢痕可能存在多年[18]。角膜屈光手术包括准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy, PRK)、准分子激光角膜原位磨镶术(laserinsitukeratomileusis, LASIK)、飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(small incision lenticule extraction, SMILE)等,术后可出现不同程度的角膜混浊,这与手术对角膜损伤的程度有关。PRK去除中央角膜上皮,术后角膜混浊的消退与EBM再生和上皮愈合有关[27]。Marino等[28]研究发现随着PRK切口处EBM完全再生,兔角膜术后出现的雾状混浊逐渐消退。当角膜上皮持续性缺损可引起CMF持续发育导致角膜混浊,因此临床上PRK术后10d内应积极促进上皮愈合,防止角膜瘢痕形成[29]。LASIK对角膜基质的损伤相对PRK较小,术后出现的圆周形角膜混浊主要由于皮瓣边缘创口相邻的基质细胞凋亡,成纤维细胞形成、迁移到切口处并进一步转化成CMF而形成的[30]。SMILE保留了上皮和EBM以避免对基质和EBM的损伤,从而减轻基质炎症更少,降低术后出现角膜混浊风险[27]。Luft等[31]研究显示与LASIK相比,SMILE术后人角膜细胞凋亡和免疫细胞浸润的情况减轻。因此,创伤、手术通过改变角膜结构的程度不同影响角膜基质修复和再生。

2.2 眼化学伤眼化学伤引起角膜混浊和瘢痕是常见的致盲原因。化学物质一定程度上影响基质重塑,主要与角膜的损伤和引起的炎症相关。化学物质毒性大,可造成角膜各层组织不同程度急性损伤,并引起炎症细胞浸润,IL-1、TNF-α等炎症因子大量释放[1,32]。上皮和基底膜缺损、基质水肿、ECM破坏等因素可导致CMF持续存在,引起基质纤维化。酸性物质导致细胞和基质蛋白凝固限制进一步渗透,而碱性物质可造成蛋白水解,穿透性强,对全层组织均可破坏[33]。眼化学伤后的预后取决于化学物质的性质、接触时间和早期治疗,临床上应积极控制炎症、促进角膜伤口愈合以预防角膜瘢痕等并发症的发生。

2.3 感染角膜感染是发达国家和发展中国家主要致盲原因。细菌、真菌或病毒等病原体的感染可造成角膜溃疡,产生不同程度的角膜瘢痕影响视力。角膜结构的恢复和对病原体的免疫反应是影响基质损伤修复的主要因素。微生物感染时先天性免疫系统激活产生炎症,引起中性粒细胞、巨噬细胞等迁移,产生IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子,对抗入侵的病原体发挥防御作用[21]。当炎症持续存在,角膜伤口愈合延迟、免疫细胞浸润、大量炎症因子释放可刺激CMF不断合成ECM,导致角膜基质纤维化[34]。因此,及时有效的抗感染、抗炎和促进伤口愈合的治疗是角膜感染的主要原则,有助于减轻角膜混浊程度。

3 角膜结构因素对角膜基质损伤修复的调控

3.1 上皮层角膜上皮位于角膜最外层,由表层细胞、翼状细胞和基底细胞组成。角膜上皮可以分泌细胞因子参与基质再生和修复。受损后,上皮细胞分泌IL-1、TGF-β和MMP等进入基质[1]。分泌的TGF-β促进CMF发育和成熟,是调节基质修复的重要细胞因子。IL-1可以激活Fas/Fas配体细胞引起基质细胞凋亡、驱动BMDC向损伤区迁移并进一步分化形成CMF、促进中性粒细胞等分泌MMP作用于损伤,从而影响基质修复[10,35]。Kobayashi等[36]将角膜上皮细胞与成纤维细胞共培养,发现角膜上皮细胞促进角膜成纤维细胞中生长因子表达增加。此外,角膜上皮缺损是影响EBM再生和基质修复的重要原因[37-38]。角膜上皮缺损会引起EBM与上皮间锚定异常,从而影响EBM功能[35]。层黏连蛋白是EBM的主要成分,持续性上皮缺损会引起上皮细胞分泌层黏连蛋白不足,引起EBM不完全再生[39]。于睿等[40]使用角膜准分子激光切除兔角膜上皮,术后4wk出现明显的角膜雾状混浊,术后使用雷帕霉素可通过促进自噬抑制角膜混浊的形成。因此,角膜上皮完整性的恢复是角膜基质创口愈合的重要影响因素。

3.2 基底膜基底膜是细胞与基质之间高度特化的ECM,角膜中存在EBM和后弹力层(descemet’s basement membrane, DBM)两种基底膜。基底膜的完整性是影响基质伤口愈合的重要因素。基底膜由层黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparin sulfate proteoglycans, HSPG)和巢蛋白组成,EBM分隔上皮与基质,DBM分隔基质与内皮。基底膜可以结合TGF-β、PDGF等生长因子,调节其生物利用度[41-42]。物理或化学因素引起角膜EBM或DBM受损,TGF-β进入基质刺激CMF形成[42]。Wilson等研究发现小鼠角膜屈光切除术后1mo EBM开始再生,角膜混浊减轻,术后4mo EBM完全再生,角膜透明度恢复[28]。DBM再生速度较EBM慢一些,DBM内皮切除术后6mo才完全再生,中央角膜恢复透明[43]。EBM完全再生限制TGF-β进入基质,CMF凋亡,正常基质细胞填补损伤区,角膜基质愈合。当EBM或DBM缺陷或不完全再生,CMF持续存在引起角膜基质纤维化[44]。基底膜蛋白多糖是EBM中主要的HSPG。de Oliveira等[45]研究发现严重损伤后再生的EBM中缺乏基底膜多糖,CMF数量增多,角膜混浊消退的时间延长。因此,促进EBM和DBM再生是恢复角膜基质透明度的重要途径。

3.3 基质层角膜基质层有基质细胞和ECM组成。各种损伤刺激角膜基质中TGF-β、PDGF上调,促进角膜基质细胞或BMDC转化形成CMF[13]。CMF是影响角膜基质修复的关键因素。CMF是特殊的成纤维细胞,具有平滑肌的结构和特征,细胞内存在应力纤维,可对外界刺激产生收缩反应[46]。CMF具有收缩性,细胞内a-SMA表达增加,收缩伤口,促进基质愈合。同时,CMF可分泌ECM成分。当CMF持续存在,大量、无序的ECM过度沉积,导致角膜透明度下降[47-48]。既往研究显示角膜屈光手术术后应用0.02%丝裂霉素C,抑制角膜基质细胞、成纤维细胞和BMDC增殖,从而减少CMF的生成,有助于治疗角膜混浊[49-50]。氯沙坦是一种抗纤维化药物,最近研究发现碱烧伤小鼠角膜局部应用氯沙坦,浅基质中TGF-β和Ⅳ型胶原蛋白减少,CMF数量减少[51]。因此,抑制基质层中CMF数量的研究有助于发现更多抑制角膜基质纤维化,从而预防角膜瘢痕的调节剂。

基质层中还存在少量角膜基质干细胞(corneal stromal stem cells,CSSCs),是促进基质修复和再生的潜在治疗工具。CSSCs是位于角膜缘处,靠近EBM的基质中具有分化为基质细胞潜能的间充质干细胞,具有干细胞分化潜能、调节角膜基质炎症和纤维化的功能[52]。Hertsenberg等[53]对小鼠混浊的角膜注射CSSCs,发现CSSCs抑制中性粒细胞向基质损伤区迁移,纤维化相关蛋白α-SMA、Ⅲ型胶原蛋白和肌腱蛋白C减少。Jhanji等[54]研究显示与单一注射CSSCs治疗相比,CSSCs和角膜基质细胞联合治疗更有效促进基质再生,减轻角膜瘢痕。CSSCs具有免疫赦免的作用,Bray等[55]发现人和兔的CSSCs共培养可通过抑制T细胞增殖抑制免疫反应。因此,CSSCs可通过向基质细胞分化和抑制炎症反应来促进角膜基质修复,有希望替代传统角膜移植成为治疗角膜瘢痕、预防移植术后免疫排斥的细胞疗法。

3.4 内皮层角膜内皮由一层内皮细胞组成,位于角膜的最内层,通过钠钾泵将基质中的水分移到内皮从而调节基质的透明度。内皮细胞数量或功能异常可引起角膜基质水肿增厚从而降低角膜透明度。此外,TGF-β促进内皮细胞发生内皮间质转化引起内皮纤维化从而降低角膜透明度[56]。当内皮细胞受到损伤后,内皮细胞Fas配体激活,扩散到基质层中与基质细胞膜表面Fas结合引起基质细胞凋亡。损伤的内皮细胞可释放IL-1进入基质。Medeiros等[57]研究显示内皮细胞机械损伤可促进基质层中基质细胞凋亡。既往研究显示内皮细胞可调节基质的透明度和细胞凋亡,但是否调控CMF的发生和发展和炎症反应尚不清楚,有待研究者进一步研究。

4 分子因素对角膜基质损伤修复的调控

4.1 小分子亮氨酸重复蛋白聚糖小分子亮氨酸重复蛋白聚糖(small leucine rich proteoglycans,SLRPs)是角膜基质中核心蛋白由富含亮氨酸重复序列组成的蛋白聚糖,分为Ⅰ型SLRPs(decorin、biglycan)、Ⅱ型SLPRs(lumican、keratocan和fibromodulin)、Ⅲ型SLRPs(osteoglycin)[58]。SLRPs调节胶原纤维的直径和间距,从而调控胶原纤维形成、组装和排列,参与ECM组装[59]。此外,损伤角膜中SLRPs结合生长因子、趋化因子、细胞因子,从而调节基质重塑、炎症和免疫反应,参与角膜基质修复[60]。既往研究表明decorin基因过表达可调节胶原纤维形成、抑制TGF-β介导的CMF形成,促进角膜基质愈合和减轻纤维化[61]。Hayashi等[62]研究发现lumican基因敲除小鼠角膜基质损伤区中性粒细胞浸润减少,胶原纤维结构紊乱,角膜透明度下降。近年来,Chouhan等[63]开发了一种含有decorin的凝胶滴眼液,可持续释放decorin发挥抗角膜瘢痕作用。SLRPs通过影响ECM的形成调节角膜基质修复,是抑制角膜基质纤维化的潜在分子靶点。

4.2TGF-β TGF-β是一种调节角膜基质再生和纤维化过程的细胞因子,通常存在健康的角膜上皮和泪液中,可分为TGF-β1、2、3三种同工型。TGF-β1、2是调节角膜基质修复和纤维化的主要介质[64],TGF-β1、2水平升高诱导CMF发育和成熟,促进基质伤口收缩,过度表达时可引起角膜基质纤维化的发生和发展[65]。同时,TGF-β可促进角膜成纤维细胞产生Ⅳ型胶原纤维,而生成胶原纤维可竞争性结合TGF-β受体,负反馈调节TGF-β水平[66]。TGFβ-3主要发挥抗纤维化作用,Weng等[67]发现CSSCs中TGF-β3水平上调,将CSSCs移植到小鼠损伤的角膜上可抑制角膜瘢痕形成。此外,基质内TGF-β可通过激活TGF-β/Smad信号通路调节细胞增殖、迁移和分化。Gupta等[68]通过基因治疗降低PRK术后兔子角膜Smad7水平,抑制TGF-β/Smad7信号通路,角膜纤维化水平显著减轻。TGF-β影响CMF形成和角膜成纤维细胞,抑制其表达及其信号传导可作为治疗角膜瘢痕和促进角膜基质再生的有效策略。

4.3 离子通道角膜受到外界刺激可引起特定离子通道激活,调节TGF-β的信号通路及细胞内信号传导影响角膜基质修复。瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel,TRP)是一类对温度、机械、化学等刺激敏感的膜离子通道,其亚型TRPV1和TRPV4可调节角膜基质炎症和纤维化[69]。Okada等[70]研究发现TRPV1基因敲除小鼠碱烧伤角膜通过下调IL-6、单核细胞趋化因子1和TGF-β1,抑制中性粒细胞、巨噬细胞的浸润和角膜基质纤维化。TRPV1参与TGF-β诱导基质纤维化,既往研究认为TGF-β刺激活性氧生成,促进成纤维细胞内TRPV1的表达,TRPV1进一步通过增加细胞Ca2+内流、激活p38/MAPK/Smad信号通路,促进CMF形成[71]。此外,TRPV4的激活也参与角膜基质纤维化,TRPV4基因敲除和使用TRPV4拮抗剂可减少小鼠碱烧伤角膜基质内中性粒细胞、巨噬细胞和CMF的数量[72]。KCa3.1是Ca2+激活离子通道,Fuchs等[73]使用一种含有KCa3.1拮抗剂TRAM-34和抗坏血酸的新型滴眼液,发现可抑制碱烧伤角膜中TGF-β诱导的基质纤维化反应。离子通道的激活可通过细胞内信号传导调节基质纤维化和炎症反应,TRPV1、TRPV4和KCa3.1离子通道是治疗角膜瘢痕的潜在药物靶点。

4.4 细胞外囊泡细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞分泌的囊泡,细胞膜内陷选择性包含蛋白质、脂质、核酸和转录因子等多种生物分子形成EVs,通过细胞间通讯调控信号通路和基因表达[74]。角膜上皮和基质通过EVs相互作用,调节基质修复和纤维化过程[75-76]。McKay等[77]从角膜上皮细胞分离出EVs与角膜成纤维细胞共培养,发现α-SMA表达增加,EVs中纤连蛋白、血小板反应蛋白和层黏连蛋白促进CMF形成。CSSCs促进角膜基质再生,其修复作用可能与CSSCs分泌EVs传递miRNA相关。既往研究从CSSCs中提取出EVs应用于小鼠碱烧伤角膜,中性粒细胞浸润减少,Ⅲ型胶原蛋白和α-SMA表达下调,体内实验表明EVs中miRNA 29a和miRNA 381抑制脂多糖诱导巨噬细胞的炎症和TGF-β诱导的纤维化反应[78-79]。姚克团队开发了一种含有间充质干细胞分泌EVs的水凝胶,EVs内miRNA 432-5p抑制胶原蛋白表达,减少ECM沉积,促进基质修复[80]。EVs具有脂质双层结构,直径小、易穿过血脑屏障,可作为药物运输载体或联合干细胞治疗促进角膜修复,在角膜再生医学中具有研究前景。

5 小结

角膜基质是影响角膜透明度的重要结构,受到各种疾病和创伤损伤后形成的角膜瘢痕是全球范围内主要致盲原因。角膜基质修复的病理生理过程包括基质细胞表型转变、ECM重塑和免疫细胞迁移,其过程可受到角膜损伤因素、角膜结构因素和分子因素的调控。外伤、手术、眼化学伤和感染等损伤因素主要改变角膜的结构和引起炎症影响角膜基质再生。角膜上皮细胞、基底膜、基质细胞、基质干细胞和内皮细胞等角膜结构参与角膜基质修复的发生和发展过程。SLRPs、TGF-β、离子通道和EVs等分子因素通过信号传导和细胞通讯调控角膜基质伤口愈合。研究角膜基质修复的机制及其调控因素对促进角膜基质再生和治疗角膜瘢痕具有重要意义。临床上可根据角膜损伤因素不同,针对性促进角膜伤口愈合和抑制炎症反应治疗疾病,从而预防晚期角膜瘢痕的发生。探究角膜结构和分子因素对角膜基质的调控作用可为促进角膜基质再生和抑制角膜基质纤维化提供新途径,帮助发现潜在治疗药物。角膜基质修复是一个复杂的级联反应,是否存在其他潜在的促进基质修复和抗纤维化的细胞和分子靶点,以及如何基于调控机制开发新型药物应用于临床有待进一步研究。