不可分型流感嗜血杆菌生物膜在儿童慢性肺部感染中的作用

陈虹宇 刘梓豪 王和平 廖翠娟 李 莉 王文建 赖建威

深圳市儿童医院（广东深圳 518038）

流感嗜血杆菌是常见的机会致病菌，常在上、下呼吸道中分离到菌株[1-3]。B型流感嗜血杆菌联合疫苗在国内儿童人群中的广泛接种[4]，使不可分型流感嗜血杆菌成为儿童呼吸道感染的主要病原菌。生物膜的生成在流感嗜血杆菌抵抗抗生素治疗中起重要作用，尤其是在中耳炎和慢性阻塞性肺疾病中进行了很多生物膜生成的研究[5-7]，但是针对儿童肺部慢性感染，如支气管扩张、持续性细菌性支气管炎和慢性化脓性肺疾病中生物膜的生成研究较少。本研究从健康儿童鼻咽部和住院的肺部感染患儿肺泡灌洗液中分离培养流感嗜血杆菌，进行生物膜体外生成能力比较，对流感嗜血杆菌在儿童肺部感染中不易被清除造成慢性感染的原因进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 流感嗜血杆菌菌株

从深圳市儿童医院临床微生物室样本库中，选取2019年2月至2021年10月从健康儿童（健康对照组）鼻咽部和肺部感染住院儿童（肺部感染组）肺泡灌洗液中分离培养的流感嗜血杆菌。肺部感染组纳入标准：①年龄1 个月至14 岁；②符合肺部感染诊断标准[8]，肺实质和/或肺间质部位感染引起机体不同程度缺氧和感染症状，通常有发热、咳嗽、呼吸增快、肺部湿性啰音，胸部影像学显示斑片状浸润影、叶或段实变影、磨玻璃影或间质性改变伴或不伴胸腔积液；③行支气管镜检查并灌洗；④灌洗液分离的临床菌株经质谱仪（梅里埃VITEK MS，法国）鉴定为流感嗜血杆菌。排除标准：①排除肺结核，肺部肿瘤，非感染性肺间质性疾病，肺水肿，肺栓塞，肺血管炎等疾病；②无法获取知情同意。健康对照组来自本院儿童保健科健康体检儿童。纳入标准：①年龄3 个月至14 岁；②鼻咽部无感染；③鼻咽部分离的临床菌株经质谱仪（梅里埃VITEK MS，法国）鉴定为流感嗜血杆菌。排除标准：①有鼻或肺部慢性基础疾病；②两周内有呼吸道感染症状；③无法获取知情同意。根据感染后病程长短将肺部感染组分为急性和慢性肺部感染组，急性肺部感染为病程＜1个月，慢性肺部感染病程≥1个月[9]。

本研究获得深圳市儿童医院伦理委员会的批准（No.2016013）。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 健康儿童和住院患儿临床资料从医院电子病历系统调取，包括年龄、性别、治疗结局。

1.2.2 流感嗜血杆菌分离 肺部感染住院患儿包括急性和慢性肺部感染，因临床需要首次进行支气管镜检查并灌洗，灌洗液进行常规细菌培养，包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌等常见细菌。按照《全国临床检验操作规程》标准，送检的肺部感染患儿灌洗液混匀后，用定量接种环分别取10 μL 接种至血平板、麦康凯平板、嗜血巧克力平板上，所有平板放入5% CO2、35 ℃孵箱培养，24和48 h后观察细菌生长情况，在嗜血巧克力平板上观察疑似流感嗜血杆菌菌落形态细菌。对疑似菌落进行分纯，所分离的临床菌株均经质谱仪（梅里埃VITEK MS，法国）鉴定。健康儿童在适合进行计划疫苗接种时用鼻咽拭子采集鼻咽部分泌物接种到血平板和嗜血巧克力平板上，培养条件和分离鉴定与灌洗液一致。

1.2.3 流感嗜血杆菌分型 从流感嗜血杆菌提取细菌总DNA，进行流感嗜血杆菌荚膜基因（bexA）的PCR检测，以B型流感嗜血杆菌ATCC10211为阳性对照，凝胶电泳观察PCR 产物，对流感嗜血杆菌进行分型。

1.2.4 不可分型流感嗜血杆菌生物膜生成检测 按照不同人群分离培养的不可分型流感嗜血杆菌分组，分别在培养第1、2、3、4和7天的时间点，采用结晶紫染色方法，酶标仪检测生物膜的生成情况。将所有菌株悬液稀释至2.0×107U/mL，200 μL/孔接种在96微孔板中，每组做3复孔试验，无菌培养液作空白对照，在5% CO2、37 ℃条件下孵育。在第1、2、3、4、7 天取出相应培养时间的标本，用无菌超纯水洗涤3次，除去杂质和未黏附的细菌，然后用0.5%（体积/重量）结晶紫染液染色15 min，无菌蒸馏水洗涤后，90%乙醇脱去染液，酶标仪在620 nm滤光片测量吸光度。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行数据分析。非正态分布计量资料以M（P25～P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料

共选取流感嗜血杆菌101株，肺泡灌洗液分离培养的流感嗜血杆菌排除非感染性疾病10株，健康儿童鼻咽部分离培养的流感嗜血杆菌排除慢性鼻窦炎2株。最终选取流感嗜血杆菌89株，其中健康对照组34株，慢性肺部感染组30株，急性肺部感染组25株。健康对照组男18例、女16例，采集样本时中位年龄12.5（6～38）月；慢性肺部感染组男16例、女14例，中位年龄48.0（36.0～87.0）月；急性肺部感染组男14例、女11例，中位年龄36.0（12.0～60.0）月。三组间性别差异无统计学意义（χ2=0.06，P=0.970），年龄差异有统计学意义（χ2=21.66，P＜0.001）；急性和慢性感染组年龄均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。所有肺部感染患儿均治愈出院。

2.2 流感嗜血杆菌分型

采用流感嗜血杆菌B型标准菌株（ATCC10211）作为阳性对照，所有临床菌株和标准株提取细菌总DNA后，对荚膜基因bexA进行PCR扩增，产物经凝胶电泳后，在凝胶成像仪下观察，发现临床菌株全部为不可分型流感嗜血杆菌（图1）。

图1 部分流感嗜血杆菌分型结果

2.3 不可分型流感嗜血杆菌生物膜在不同时间点体外生成情况

慢性肺部感染组在不同时间点（第1、2、3、4、7天）之间的吸光度差异有统计学意义（P＜0.05），慢性感染组在第4 天的吸光度中位数为最高。急性肺部感染组和健康对照组吸光度中位数变化不大，不同时间点之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 不同时间点各组不可分型流感嗜血杆菌生物膜形成情况[M(P25～P75)]

第4天，健康对照组、急性肺部感染和慢性肺部感染组之间的吸光度差异有统计学意义（P＜0.05），慢性肺部感染组吸光度高于健康对照组和急性肺部感染组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

自B 型流感嗜血杆菌联合疫苗推广使用以来，不可分型流感嗜血杆菌已经成为主要的条件致病菌之一，主要引起儿童中耳炎和社区获得性肺炎或老年人慢性阻塞性肺病恶化[10-13]。本研究中所有从健康儿童鼻咽部或者肺部感染患儿肺泡灌洗液[14]分离到的均为不可分型流感嗜血杆菌，与国内外研究一致[15-16]，说明在本地区流行的主要菌株为不可分型流感嗜血杆菌。

大量研究表明，不可分型流感嗜血杆菌形成生物膜可能是此种细菌发病机制中的重要一步。本研究分析不同人群呼吸道分离的不可分型流感嗜血杆菌生物膜体外生成情况，发现慢性肺部感染患儿肺泡灌洗液分离菌株生成能力最强，与中耳炎反复感染和慢性阻塞性肺疾病患者分离菌株类似[7,17]，考虑慢性感染中，不可分型流感嗜血杆菌在肺部长期生存，部分菌株通过生物膜的生成以逃避抗生素对其的清除。另外也有研究发现，不可分型流感嗜血杆菌生物膜与急性感染或反复感染中耳炎的治疗没有直接关系[18]，因此不可分型流感嗜血杆菌生物膜抵抗抗生素治疗的作用机制还需更深入的研究。而健康儿童鼻咽部定植菌株和急性肺部感染分离菌株生物膜体外生成能力比较一致，提示急性肺部感染时，不可分型流感嗜血杆菌可能与儿童当时的身体状况相关，而与菌株自身的特征如生物膜的生成关系不大，但需要进一步研究证实。

本研究中，肺部感染特别是慢性感染患儿，临床样本采集时的中位年龄为48个月，可能与诊断慢性感染需要多次反复感染有关[3,12,19]，而急性感染患儿肺泡灌洗液采集时年龄为36个月，也显著高于健康对照组，可能与不可分型流感嗜血杆菌引起急性肺部感染后重症患儿年龄偏大有关。所有肺部感染患儿治疗后均治愈出院，生物膜在儿童肺部感染中的作用还需深入研究。在儿童中耳炎和成人慢性阻塞性肺疾病中，不可分型流感嗜血杆菌生物膜的生成机制是当前研究的热点[7,20]，在儿童慢性肺部感染中的不可分型流感嗜血杆菌生物膜生成机制和作用机制是否与中耳炎或者慢性阻塞性肺疾病一致需进一步研究证实。

本研究中对照组为健康儿童鼻咽部分离菌株，菌株分离的部位不同可能对结果有一定的影响。但是健康儿童鼻咽部分离菌株和急性肺部感染菌株，在生物膜生成上基本一致，提示急性感染可能大部分是从鼻咽部定植菌或环境中的菌株直接进入肺部引起感染。另外，结晶紫方法检测生物膜生成为经典方法，与目前采用共聚焦显微镜方法检测生物膜的生成可能存在一定差异[21]，有待于今后进一步研究探讨。