地龙药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的含量检测*

李正刚，程 焱，王丹彧，赵 艳，马 彧

（1.四平市食品药品检验所，吉林四平 136000；2.吉林省药品检验研究院，吉林长春 130000）

黄曲霉毒素主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，是目前已知最强致癌物之一[1]。其毒性远高于氰化物、重金属及有害元素等，对人类健康危害极大[2，3]。当微量持续摄入，可造成慢性中毒、生长障碍，引起纤维性病变，致使纤维组织增生。当摄入量大时，可发生急性中毒，出现急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生[4，5]。

根据被检测样品的基质性质、检测仪器设备情况以及检测时限要求等，黄曲霉毒素有多种检测分析方法，包括酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、胶体金快速定量法、实时荧光PCR 方法、高效液相色谱串联质谱法等[6，7]，但以上方法均需要多种分析试剂及仪器，操作复杂，并且如质谱分析仪器多为进口国外产品，价格较为昂贵，因此，开发更加简便快捷、低成本的方法仍然是现阶段分析工作者需要努力解决的问题。

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉盲环毛蚓的干燥体。具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效。前3 种习称“广地龙”，后1 种习称“沪地龙”。临床常用于高热神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肢体麻木、半身不遂、肺热喘咳、水肿尿少等病症的治疗。地龙保存不当非常容易出现黄曲霉毒素超标。本文建立了超声提取-免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生，高效液相色谱-荧光检测法进行多产地、多批次地龙药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量测定。经方法学验证，该方法操作简便、灵敏度高、重复性好、结果准确，所用仪器简单，可用于地龙中黄曲霉毒素含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器

Agilent LC1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Agilent LC1260II 型荧光检测器（美国安捷伦科技有限公司）；KRC-25 型光化学柱后衍生器（青岛普瑞邦生物工程有限公司）；KQ-350VDB 型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；Pribo Fast IAC 免疫亲和柱（青岛普瑞邦生物科技有限公司）。

1.2 药材和试剂

黄曲霉毒素（AF）混合对照品溶液（B1、B2、G1、G2标示浓度分别为1.04μg·mL-1、0.38μg·mL-1、1.08μg·mL-1、0.38μg·mL-1），批号：610001-202006，来源为中国食品药品检定研究院。

NaCl（AR 上海国药化学试剂公司）；甲醇（色谱纯美国赛默飞世尔科技有限公司）；实验用水为超纯水。

本次收集到不同产地和批次的地龙药材共10批，基本信息见表1。

表1 地龙药材样品基本信息Tab.1 Basic information of Pheretima samples

1.3 仪器工作条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，50×4.6mm）；流动相：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速为1.0mL·min-1；柱温为25℃；柱后光化学衍生波长为254nm；荧光检测器检测，激发波长λex=360nm，发射波长λex=450nm。

1.4 标准溶液的制备

精密量取AF 混合对照品溶液0.5mL, 置10mL量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，作为储备溶液。精密量取储备溶液1mL，置25mL 量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得。

1.5 样品溶液制备

样品粉碎过120 目筛网，取供试品粉末约5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入NaCl 3g,精密加入70%甲醇溶液75mL，超声30min，4500r·min-1离心5min，精密量取上清液15mL，置50mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，4500r·min-1离心10min，精密量取续滤液10.0mL，通过免疫亲和柱，流速3mL·min-1，再用20mL 水洗脱，弃去洗脱液，使空气进入免疫亲和柱，将水挤出，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22μm）滤过，取续滤液，即得。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方式

样品的提取方式有多种多样，需要根据样品的具体基质情况进行处理，不同基质，如动物药和植物药的基质有很大差别，则提取的方式也不同。同时测定方法的选择也要根据实验室的仪器设备情况来选择。本次实验采用超声提取法，离心过滤后，经过免疫亲和柱净化，液相色谱分离后，再经光化学衍生，荧光检测器检测。经方法学验证，方法的专属性、重复性、回收率均满足要求。且方法所用仪器简单，适合大批量样品的检验检测及分析[8-10]。

2.2 色谱图

分别精密吸取“1.4”项下混合对照品溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色谱仪。另精密吸取“1.5”项下供试品溶液20μL，注入液相色谱仪。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且无杂质干扰峰，结果见图1。

图1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 的色谱图Fig.1 Chromatograms of aflatoxin of AF B1、B2、G1、G2

2.3 线性范围和检出限

分别精密吸取“1.4”项下混合对照品溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量（ng）为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。

取不含AF 的样品5g，加入适当稀释的AF 混合对照品溶液，同供试品溶液制备、测定，以信噪比（S/N）为3 作为4 种黄曲霉毒素的检出限（LOD），结果见表2。表明方法的线性关系较好，灵敏度均满足要求。

表2 回归方程、线性范围、检出限Tab.2 Regression equation, linear range and detection limit

2.4 稳定性实验

取“1.4”项下对照品溶液，分别于0、4、8、16、18、24h 按“1.3”色谱条件进样10μL，记录所测各组分峰面积，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2峰面积的RSD（n=6）分别为3.1%、2.5%、2.5%、2.8%，结果表明，对照品溶液在24h 内稳定。

2.5 重复性实验

取供试品（样品编号：DL7）粉末约5g，精密称定6 份，按“1.5”供试品溶液制备方法操作，按“1.3”色谱条件进样10μL，进行测定。结果6 份样品中黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2含量的RSD（n=6） 分别为2.5%、2.1%、2.3%、2.5%，结果表明，方法的重复性较好。

2.6 回收率实验

精密称取6 份不含AF 的供试品（样品编号：DL1）粉末约5g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入黄曲霉毒素混合对照品储备液25μL，按“1.5”供试品溶液制备方法操作，按“1.3”色谱条件测定，计算回收率，结果见表3，表明方法的准确性较好。

表3 回收率实验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery rate test（n=6）

2.7 样品测定

本次共收集到10 批次地龙药材，每份样品平行取样，测定结果见表4。

表4 样品测定结果（μg·kg-1，n=2）Tab．4 Sample determination results（μg·kg-1，n=2）

由表4 可见，10 批样品中有8 批未检出AF，其它2 批检出AF，且4 种AF 均有检出，有1 批样品中的AF 总含量超出《中国药典》2020 年版（一部）中药材中AF 总含量不大于10μg·kg-1的限量规定。

3 结论

采用超声萃取-免疫亲和柱净化-柱后光化学衍生法对样品进行提取净化，并结合高效液相色谱荧光检测技术，建立了地龙中4 种黄曲霉毒素的快速测定方法。该方法操作简便，所用设备简单，检测效率高，可以实现批量样品的快速提取。且方法准确可靠，适用于地龙中黄曲霉毒素定量检测。特别适合于中小企业作为内部质量控制的检测方法。