减氮条件下生物炭基肥对土壤养分及细菌群落结构的影响

吴东,李茂森,李帅兵,董贤春,牟毅,王博,唐婷婷,唐韵,赫英宇,任天宝

(1.湖北中烟工业有限责任公司,湖北 武汉430048;2.河南农业大学烟草学院/河南省生物炭研究工程技术中心,河南 郑州450002;3.黑龙江省烟草公司牡丹江烟叶公司,黑龙江 牡丹江157011;4.湖北省烟草公司宜昌市公司,湖北 宜昌 420500)

土壤细菌是土壤微生物中数量最多,组成最复杂的一类生物,其相对丰度达到70%～90%,是土壤有机质分解,腐殖质形成的重要承担者,其物种多样性和群落组成结构是衡量土壤健康和养分水平的重要指标[1-2]。烟草是中国重要的经济作物,烟叶的品质决定了中国烟草行业的发展状况,由于耕地面积有限,目前中国烤烟生产中存在着常年连作和长期化肥施用等问题,导致植烟土壤微生物多样性降低,微生物群落结构失衡,土壤中益生菌丰度降低,病原菌大量积累,严重影响了烟叶品质[3]。王伟华等[4]研究发现,长期单施化学提高了土壤总氮、全磷含量,但对有机质没有显著的影响,有机肥和氮肥配施显著提高了土壤有机质、总碳、总氮、全磷和速效磷含量。唐海明等[5]研究发现,60%无机肥和40%化肥配施有利于提高微生物对土壤碳源的利用效率,长期单施化肥土壤细菌多样性显著降低。陈丹梅等[6]通过长期定位试验研究发现,长期施用化肥植烟土壤有机质含量下降20.56%,真菌种群数量增加,病原微生物相对比例增大。改变施肥模式,增加有机肥的施用可对土壤产生重要影响[7]。

生物炭是一种富碳的黑色固体产物,主要由农林废弃物(秸秆、污泥、粪便等)在高温低氧环境中烧制而成,其碳含量高达70%以上,对于土壤有机质提升、土壤碳氮比调节有着积极的作用。生物炭本身孔隙结构丰度,为土壤细菌和真菌提供生存环境,对提高土壤酶活性,增加土壤微生物量起着积极的作用[8-9]。生物炭由高温热解制成,其本身的养分含量有限,且难以被土壤微生物分解或矿化,已成为土壤改良重要的原料[10],以生物炭主要原料制成新型的生物炭基肥,具有减氮增效的作用[11]。研究发现施加生物炭基肥能够显著提高土壤有机质含量,增加土壤速效养分含量,提高土壤酶活性和细菌群落多样性[12-13]。汪坤等[14]研究发现,施加生物炭基肥提高了烤烟土壤酶活性,增强了烤烟的抗病性。刘福童等[15]通过施加生物炭基肥,发现土壤有机质含量显著提高,土壤酶活性增强,土壤细菌多样性显著增加。高梦雨等[16]通过研究生物炭基肥与等量碳素或氮磷钾肥料对棕壤土碳组分的影响,发现长期施用生物炭和炭基肥可以显著提高土壤有机碳含量,且对土壤速效养分的提升效果更优。常栋等[17]研究发现,施加生物炭可以促进土壤微生物对土壤中碳源的利用程度,并显著提高了土壤脲酶、蔗糖酶和多酚氧化酶等土壤关键碳氮循环酶活性。IBRAHIM等[18]发现,施用烟秆炭基肥能够显著增强土壤氮循环酶活性,改善土壤微生物群落结构。GAO等[19]研究发现,施加生物炭显著改变了土壤细菌群落组成,随着生物炭施加量的增加,土壤放线菌的丰度降低,变形菌门和酸杆菌门的相对丰度增加。而王明元等[20]研究发现,施加生物炭后,土壤拟杆菌门、疣微菌门和厚壁菌门的相对丰度显著增加,酸杆菌门、芽单胞菌门明显减少。

生物炭基肥在土壤健康培育、微生态调控等方面发挥着重要的作用。目前,有关生物炭基肥对烤烟生长发育、土壤理化特性已有较多研究,但关于生物炭基肥对植烟土壤微生物群落调控机制研究较少。本试验在植烟土壤中添加生物炭基肥,通过测定土壤中的养分指标,使用高通量测序技术分析土壤细菌群落,探究了生物炭基肥对土壤理化指标及细菌群落结构的影响,为生物炭基肥在西南高海拔山区植烟土壤微生物群落结构调节和土壤改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

于2021年4—9月在遵义市播州区乐山镇进行试验。该烟区为烟菜轮作,土壤为黄棕壤,其基础理化性质为:pH值6.35、有机质20.12 g·kg-1、碱解氮120.45 mg·kg-1、速效磷42.36 mg·kg-1、速效钾224.62 mg·kg-1。供试品种为云烟87,由遵义烟草公司提供,烤烟大田栽培措施按照当地优质烟叶生产技术进行。

1.2 试验设计

试验设置1个常规施肥处理和3个不同生物炭基肥梯度处理:常规施肥(CK)、0.6 t·hm-2(T1)、0.9 t·hm-2(T2)和1.2 t·hm-2(T3),每个处理重复3次。生物炭基肥由生物炭和植物油粕等制成:生物炭质量分数为40.51%,芝麻饼肥质量分数为20.16%。其中有机质质量分数大于45.21%,有效养分质量分数大于5%,m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1∶1∶2.8。为保证试验的一致性,除CK处理外,其余处理均在常规施肥的基础上减氮10%。常规施肥:烟草专用肥0.525 t·hm-2,m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=10∶10∶24。生物炭基肥于起垄前条施。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤样品的采集 根据5点取样法,每个处理取长势一致的烟株3株,挖出整个根部,收集根系表面0～4 mm的土壤,保存在10 mL无菌离心管中,一部分用干冰保存进行微生物多样性检测,剩余部分在阴凉处自然风干后研磨,用于土壤理化性质分析。

1.3.2 农艺性状的测定 参考YC/T 142—1998 烟草农艺性状调查方法,在移栽后90 d测定烤烟农艺性状,在每个处理选取10株长势均匀的烟株,分别测量株高、自上而下第10片叶处茎围,最大叶叶长、叶宽。

1.3.3 土壤理化指标及养分的测定 参照文献[21]进行测定。土壤含水率(SWC)的测定采用烘干法;土壤容积质量(SBD)采用环刀法测定;pH的测定采用超纯水做浸提剂,按照m(土)∶m(水)=1∶2.5的比例浸提,用精密pH计(型号:BPH305)直接测定;土壤速效磷(AP)采用碳酸氢钠浸提法测定;土壤有机碳(SOM)采用浓硫酸-重铬酸钾外加热法测定;碱解氮(AN)采用碱解扩散法。

1.3.4 土壤细菌的检测 采用 DNA 抽提试剂盒(E.Z.N.A.®soil)对样本的DNA 进行提取,以稀释后的基因组 DNA 为模板,根据测序区域的选择,对16SV3～V4 区进行扩增,引物序列为 343F(5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’)和798R(5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)。使用Takara公司的 Takara Ex Taq高保真酶进行PCR扩增。PCR产物使用电泳检测,检测后进行纯化,纯化后作为二轮PCR模板,并进行二轮PCR扩增,并再次使用电泳检测,检测后再次纯化,纯化后对PCR产物进行 Qubit定量,根据 PCR产物浓度进行等量混样,并上机测序[8]。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2021分析数据,用SPSS 26.0软件分析处理数据,方差分析采用最小显著性差异法,主成分分析和细菌群落结构弦图分别用用R语言中的factoextra和 circlize包进行绘制。

2 结果与分析

2.1 生物炭基肥对成熟期烤烟农艺性状的影响

由表1可以看出,施加生物炭基肥,烤烟的农艺性状指标显著提高,与CK处理相比,T1、T2、T3处理的烤烟株高分别增加了11.07%、12.14%和8.21%;T2和T3处理烟株茎围较CK处理有显著增加,分别为7.46%和7.96%;T1、T2、T3处理的烟株最大叶叶长分别增加了6.03%、8.29%和3.52%,其中T2处理最大叶叶长较CK显著增加;T1、T2、T3处理的烟株最大叶叶宽与CK处理均不存在显著差异,其中T3处理叶宽小于CK处理。

表1 成熟期烤烟农艺性状

2.2 生物炭基肥对成熟期烤烟根际土壤理化性质的影响

由表2可以看出,与CK处理相比,T1、T2、T3处理均显著提高了土壤pH值,且随着炭基肥施加量的增加,土壤pH值也呈增加的趋势;T1、T2、T3处理土壤容积质量较CK处理降低了6.33%、12.41%和16.46%,均达到显著水平。施加生物炭基肥后,土壤有机质、碱解氮、速效磷、速效钾含量相较于CK处理均显著增加,增加幅度分别为19.05%～27.64%、5.25%～14.67%、4.99%～15.16%和5.07%～14.83%。

表2 成熟期烤烟根际土壤理化性质

2.3 生物炭基肥对烤烟根际土壤细菌α多样性的影响

对12个样本进行高通量分析,共获得有效序列670 548条,从图1中可以看出,4个处理共有的分类操作单元数(OTUs:operational taxonomic units)有1 789条,3个生物炭基肥处理所独有的OTUs分别为776、617和501。

图1 土壤细菌OTUs数

从表3可以看出,施加生物炭基肥后,土壤细菌多样性有降低的趋势,且随着炭基肥施加量的增加,细菌多样性表现出先升高后降低;除T1处理外,T2、T3处理Chao1指数和ACE指数均小于CK处理,随着生物炭基肥施加量的增加,土壤细菌丰富度表现出下降的趋势。本试验中样本测序覆盖率均达到98%以上,满足后续分析。

表3 成熟期烤烟根际土壤细菌α多样性

2.4 生物炭基肥对烤烟根际土壤细菌群落多样性的影响

2.4.1 生物炭基肥对门水平细菌群落结构的影响 由图2可知,门水平上土壤优势细菌群落为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)。T1和T2处理变形菌门(Proteobacteria)相对丰度高于CK处理,T3处理变形菌门(Proteobacteria)相对丰度低于CK处理。3个生物炭基肥处理的厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度均大于CK处理,分别增加了388.87%、7.75%和143.22%;放线菌门(Actinobacteriota)和绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度的变化在4个处理中较为一致,均为T2>T3>T1>CK。3个生物炭基肥处理的拟杆菌门(Bacteroidota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)相对丰度均小于CK处理,降低的幅度分别为39.60%～72.85%和10.43%～45.08%。

注:图中数值代表一个菌在4个处理中的丰度之和。下同。

2.4.2 生物炭基肥对纲水平细菌群落结构的影响 从图3中可以看出,烤烟根际土壤优势门水平细菌群落为芽孢杆菌纲(Bacilli)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)、α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)。T1处理芽孢杆菌纲(Bacilli)相对丰度显著高于其余处理,较CK处理提高543.69%,γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)相对分度为T1>T3>CK>T2,T1处理较CK处理提高了33.82%。拟杆菌纲(Bacteroidia)随着施加生物炭的量增加而降低,较CK处理分别降低了70.58%、47.81%和46.74%。施加生物炭后,纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)相对丰度变化量较大,T1、T2和T3处理分别提高了434.45%、662.01%和631.15%。除T2处理外,其余两处理的α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)丰度相较于CK处理均降低,分别为33.23%和27.54%。

图3 纲水平细菌群落结构

2.5 根际土壤细菌群落LEfSe分析

利用LEfSe差异分析,筛选出4种土壤中具有显著差异的微生物(LDA阈值为2)。由图4可知,CK处理硝化螺旋菌门(Nitrospirota)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)和梭菌科(Pyrinomonadaceae)显著富集;T1处理肠球菌科(Enterococcaceae)和肠球菌属(Enterococcus)显著富集;T2处理弧菌(Vibrio)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)显著富集;T3处理绿弯菌门(Chloroflexi)显著富集。

2.6 生物炭基肥对细菌β多样性的影响

如图5所示,样本组成差异在PC1轴和PC2轴上的值分别为57.5%和31.5%。从图5中可以看出,CK处理与施加生物炭处理在PC1轴上分离,说明施加生物炭对土壤细菌群落有明显的影响。T1、T2和T3处理样本点依次在PC2轴上分布,T1和T3处理样本点距离较近,说明T1和T3处理的土壤细菌群落结构相似,T2处理与其他3个处理样本点距离较远。

图5 基于OTUs的土壤细菌群落PCA分析

2.7 土壤门水平细菌群落结构与土壤理化性质相关性分析

表4为门水平上优势菌群与土壤理化性质之间的关系。从表4中可以看出,绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤速效磷和速效钾有显著正相关(p<0.05),与土壤pH和有机质呈极显著正相关(p<0.01),与土壤容积质量呈显著负相关(p<0.05)。变形菌门(Proteobacteria)与土壤容积质量呈正相关,与土壤pH值、有机质、碱解氮、速效磷和速效钾呈负相关。厚壁菌门(Firmicutes)与土壤pH值和有机质呈正相关关系,与土壤容积质量、碱解氮、速效磷和速效钾呈负相关。

表4 细菌优势门类与土壤理化性质的相关关系

3 结论与讨论

3.1 生物炭基肥对烤烟土壤理化性质的影响

已有研究表明,在土壤中施加炭基肥后,土壤速效养分和有机碳含量有显著的提高,作物生长发育得到促进,从而作物的产量也有显著的增加[22]。本研究发现,在土壤中施加生物炭基肥可以显著的提高土壤pH值,且土壤pH值随着生物炭基肥施加量的增加而增加,这是因为生物炭其本身呈碱性,pH值在7至10.5之间[23],以生物炭为载体的生物炭基肥在很大程度上保留了生物炭的特性,因此可以显著的增加土壤的pH值,对于酸性土壤改良具有良好的效果。本研究发现,施加生物炭后,土壤碱解氮等速效养分含量相较于CK处理有较明显的增加,但随着生物炭基肥施加量的增加,土壤中的养分的含量没有明显的变化,这可能是由于生物炭本身具有吸附的性质,减缓了生物炭基肥料中养分的释放,这可以为烟草中后期的生长发育提供良好的肥效,这与陈懿等[24]研究结果一致,施加炭基肥显著的提高了土壤pH和速效养分含量,同时研究发现生物炭对肥料的养分具有良好的吸持效果,可以有效的促进土地肥力。宋大利等[25]和DEMISIE等[26]研究发现,将生物炭和无机肥粒配施显著的增加了土壤有机碳及其组分含量,可以更好地改善土壤质量。本研究发现,施加炭基肥后土壤有机质含量有着明显的增加趋势,这和冯慧琳等[27]研究结果相似。这是由于生物炭基肥本身含有的有机质释放到了土壤中,增加了土壤中有机质的含量。WANG等[28]研究发现,施加化肥和生物炭均能显著增加土壤的碳氮组分,施加生物炭可以显著的提高土壤碳氮比,但是单施化肥会对土壤碳氮比产生不利的影响。本研究发现,土壤有机质和速效养分含量随着生物炭基肥施加量的增加,呈现先上升后趋向稳定的趋势;烤烟株高和最大叶长宽也是随着炭基肥施加量的增加呈现先上升后下降的趋势,其中T2处理的各个指标均为最高。本试验为生物炭基肥和化肥混合施用,随着生物炭基肥施加量的增加,土壤中生物炭和氮肥、钾肥的比例升高,生物炭表面较活跃的离子交换量和活跃的基团对速效养分的吸附效果增强,限制了肥料养分的释放[29]。因此,施加适量的生物炭基肥更有利于土壤养分的提高和植株的生长发育。

3.2 生物炭基肥对烤烟土壤细菌多样性及群落结构的影响

生物炭基肥的施用会驱动土壤生物化学环境发生变化,影响土壤微生物的生存条件,从而改变土壤微生物群落的组成和多样性[30]。生物炭含有大量的孔隙,是微生物生存的适宜场所[31],同时生物炭具有的一些有机质也为微生物的繁殖提供了一定的养分,对微生物的生长、发育和代谢具有促进作用[32]。在本试验中,与常规施肥相比,施加炭基肥增加了放线菌门的丰度,这与REN等[33]的研究一致。放线菌适宜在碱性环境下生存,施加生物炭基肥后,土壤pH值上升,更加适合放线菌生长发育。研究发现,施加生物炭基肥后,拟杆菌门和酸杆菌门丰度降低,与放线菌门相反,酸杆菌门是嗜酸性细菌,酸性土壤更有利于其生存,施加生物炭后,土壤pH值上升,导致酸杆菌门丰度降低。

本研究表明,施加炭基肥促进了土壤变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的生长,生物炭独特的孔隙结构为微生物的生长发育提供了生存基础,从而影响了细菌的群落结构。同时,生物炭基肥可以调节土壤的理化性状,如降低土壤容积质量等,间接影响了微生物在土壤中的生存模式,对微生物的生长、发育和代谢起到了一定的调节作用[34]。细菌群落主成分分析结果表明,生物炭基肥驱动了土壤中的细菌群落结构发生改变,并具有一定的趋向性,这与苏鑫等[35]研究结果一致。相关性分析表明,土壤中优势细菌与土壤pH值,有机碳、速效钾等理化特性均存在相关性。其中,变形菌门与土壤容积质量呈正相关关系,与土壤pH值、有机质、碱解和速效钾呈负相关绿弯菌门与土壤pH值、速效磷和速效钾有显著正相关关系,与土壤容积质量呈显著负相关。这与桑文等[36]研究结果一致,但胡坤等[1]研究发现,绿弯菌门会随着土壤pH值的上升呈下降的趋势,这可能是由于研究对象的不同,生物炭基肥对土壤中的微生物产生了不同的驱动效应。

生物炭基肥显著增加了土壤pH和有机质含量,提升土壤肥力,促进烟株的生长发育。低施肥量可以增加土壤细菌丰富度,施加生物炭基肥显著的影响了细菌群落结构,提高了变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度,降低了拟杆菌门(Bacteroidota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)的相对丰度。相关性分析结果表明,绿弯菌门(Chloroflexi)受土壤理化性质的驱动较为明显,与多种土壤理化指标均显著相关。综上所述,生物炭基肥对土壤pH值、有机质、速效养分含量和土壤微生物有着积极的影响,对西南高海拔烟区烤烟栽培减氮施肥和土壤改良具有重要意义。