配合饲料对翘嘴鳜肠道组织结构及其免疫功能的影响

黄小鹏，姚晓丽，郑 佳，赵金良

(1.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306；2.上海海洋大学，水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心，上海 201306；3.上海海洋大学，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306)

对肉食性鱼类而言，随人工配合饲料替代活饵鱼或者冰鲜鱼的进程不断推进，配合饲料对肉食性鱼类生长性能与营养价值等方面的影响受到关注[1]。由于配合饲料中含有某些肉食性鱼类难以充分消化的原料，如淀粉和植物性蛋白等，且与活饵鱼的营养成分组成差异较大，可能会引起鱼体生长性能下降，甚至影响鱼体机体健康[2]。有研究表明采食配合饲料影响了肉食性鱼类肠道的结构完整性，如人工配合饲料投喂下，龙胆石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)[3]和大口黑鲈(Micropterussalmoides)[4]生长性能均下降，肠道黏膜厚度、绒毛高度显著降低；采食膨化饲料后，乌鳢(Ophiocephalusargus)肠道绒毛数量和长度减少，隐窝深度增加，且随着碳水化合物含量的增加和饲养周期的延长，中肠的肠绒毛密度和高度逐渐变疏变短[5]。

鱼类肠道上皮细胞分泌的补体和免疫细胞产生的非特异性免疫因子，如溶菌酶、免疫球蛋白等在机体防御中发挥了重要的保护作用。炎性基因IL-1β、TNF-α、IL-10和IL-4等参与介导和调控免疫和炎症过程，引起先天和适应性免疫反应[6]。研究发现，肠道营养可保护肠道黏膜和免疫系统，有调节免疫细胞活性和细胞因子产生等作用，可减少感染和降低死亡率。食物中的营养成分组成，是影响鱼类先天免疫反应的主要因素[7，8]，因此，配合饲料替代活饵鱼可能会对肉食性鱼类肠道的免疫作用产生一定的影响。

翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)是典型的肉食性鱼类，传统养殖模式是全程投喂活饵料鱼。20世纪80年代后期以来，翘嘴鳜饲料驯化技术、饲料营养与配方、饲料养殖研究均取得了一定的进展[9-11]。研究表明，配合饲料喂养条件下，杂交鳜(翘嘴鳜×斑鳜)、翘嘴鳜均表现有生长速度减慢[12]，胃黏膜下层和肌层厚度降低，肠绒毛分支减少[13]，肠道蛋白酶活性降低[14]等的现象。翘嘴鳜饲料组肠道消化、小肽吸收与活饵组有明显差异[13]，肠道微生物多样性明显低于活饵组[15]，而SHEN等[16]通过对翘嘴鳜多个组织器官进行转录组数据分析得出，翘嘴鳜通过调节自身结构和多种基因表达水平来适应食物的改变。相关研究表明，配合饲料对翘嘴鳜肠道结构有一定的影响，但未以具体的肠道参数来描述配合饲料对肠道的影响程度，配合饲料对翘嘴鳜肠道免疫影响的研究也较少，因此，本实验研究配合饲料对翘嘴鳜肠道组织结构及其免疫功能的影响，以为饲料翘嘴鳜健康养殖发展提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的翘嘴鳜购自浙江省湖州市南浔菱湖某家庭农场，全长(5.16±0.44)cm，实验前暂养于上海海洋大学滨海基地水泥池。适应1周后，将实验鱼分为活饵组(LB)和饲料组(CF)，每组3个重复，每个重复30尾。养殖在体积为0.084 m3的水缸中。活饵组投喂适口鲮，饲料组按曾萌冬等[13]的方法进行慢性驯化。翘嘴鳜专用饲料粉购自浙江益祥生物科技有限公司，投喂前按7∶3的比例取粉状料和水使用制粒机混匀并挤压成条状。各处理组每天饱食投喂2次，时间分别为9：00和17：00。共进行为期8周的投喂(LB投喂8周活饵鱼，CF用饲料驯化2周，后保持投喂6周)。活饵鱼和配合饲料的主要营养组分见表1。

表1 配合饲料和活饵鱼的主要营养组分Tab.1 Nutrient components of compound feed and live bait %

1.2 方法

1.2.1 样品的采集

养殖试验结束后，统计各个重复组的存活数量，计算其存活率。随机挑取活饵组和饲料组各15尾，用MS-222麻醉液(400 mg/L)进行麻醉，测定其全长、体长和体质量。并取前肠、中肠和后肠。每组取6尾用Bouin′s固定液固定24 h，再用70%乙醇反复浸洗至无色，用于制作组织切片；每组取9尾用无酶水清洗肠内容物后将肠道组织装于冻存管，放入液氮速冻，-80 ℃冰箱保存，用于荧光定量PCR和ELISA检测。

1.2.2 营养成分测定

粗蛋白含量测定采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)，粗脂肪含量测定采用索式抽提法(GB/T 5009.6-2003)，粗灰分测定采用550 ℃灼烧称重法(GB/T 5009.4-2003)，水分含量测定采用105 ℃干燥法(GB/T 5009.3-2003)。

1.2.3 肠道组织切片制作

取固定好的前肠、中肠和后肠样本，经80%～100%(体积分数)乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡3 h，石蜡包埋。使用Leica RM 2016型切片机进行连续切片，厚度约为7 μm，经HE和AB-PAS染色，然后树胶封片，置于尼康ECLIPES 80i光学显微镜下进行观察拍照。测量绒毛高度(肠绒毛基部至顶端的垂直距离)和隐窝深度(肠隐窝底部至肠壁固有层的垂直距离)，并计数杯状细胞数目。

1.2.4 免疫酶活性和含量测定

取冻存的前肠、中肠和后肠样本，用PBS缓冲液(pH7.4)洗净肠道内容物，吸水纸吸干水分。称量样本重量，加入9倍量的PBS缓冲液，在冰浴中充分匀浆，匀浆液4 ℃下3 000 r/min离心15 min，取上清液用于测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LYS)活性和补体C3、免疫球蛋白IgM含量，酶活和蛋白含量均采用上海酶联生物科技有公司的ELISA试剂盒进行测定，操作步骤详见试剂盒说明书。

1.2.5 炎性基因定量表达分析

参照组织RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明提取总RNA，去除基因组DNA杂质，并反转录合成cDNA，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。基于NCBI数据库获得的翘嘴鳜IL-1β、TNF-α、IL-10和IL-4基因开放阅读框序列，以β-actin为管家基因，在NCBI数据库的Primer-BLAST程序中完成引物设计，委托上海金唯智生物科技有限公司合成，引物序列见表2。实时荧光定量PCR反应体系20.0 μL：2x SYBR Green Prc Taq HS Premix，10 μL；cDNA，1 μL；Primer F，0.4 μL；Primer R，0.4 μL；RNase free water，8.2 μL。扩增程序：95 ℃，30 s；95 ℃，8 s，56 ℃，30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法换算目的基因的相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR扩增引物序列Tab.2 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR amplification

1.2.6 统计分析

所有结果均以平均值±标准差表示，采用SPSS 22.0统计软件处理数据，并通过t检验比较配合饲料组与活饵鱼组各指标间的差异，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 配合饲料对翘嘴鳜生长性能的影响

投喂8周配合饲料后翘嘴鳜生长指标如表3所示。翘嘴鳜活饵组的全长、体长、体质量和存活率均显著高于饲料组。

表3 配合饲料投喂8周后翘嘴鳜的生长指标Tab.3 Growth indexes of S.chuatsi after being fed with compound feed for eight weeks

2.2 配合饲料对翘嘴鳜肠道组织结构的影响

翘嘴鳜活饵组和饲料组肠道组织结构如图1所示。活饵组前肠结构完整，肠绒毛长而紧密，且分支较多，几乎充满整个肠腔(图1-a)；中肠肌层较薄，但绒毛更加密集，且分支更多(图1-b)；后肠肌层最厚，绒毛细长且分支较少，绒毛相对稀疏(图1-c)。活饵组前、中、后肠纹状缘光滑平整，黏膜上皮细胞排列有序，杯状细胞分布均匀(图1-d、e、f)。

饲料组前、中肠肠绒毛均显著变短，后肠皱襞结构较为完整，绒毛相对较长(图1-g、h、i)。肠道黏膜中纹状缘出现缺口，且肠绒毛上皮细胞排列紊乱，杯状细胞数量剧增(图1-j、k、l)。

翘嘴鳜活饵组和饲料组肠道形态学指标如表4所示。饲料组前、中、后肠的肠绒毛长度均显著短于活饵组，分别降低了57.41%、47.95%和35.13%。饲料组前、中、后肠隐窝深度均显著高于活饵组，分别上升了33.68%、57.19%、95.18%。饲料组前、中、后肠绒毛高度与隐窝深度比值均显著低于活饵组，分别降低了68.35%、67.86%和64.67%。饲料组前、中、后肠杯状细胞分布密度均显著大于活饵组，分别增加了62.72%、100.05%和85.10%(图2)。

表4 翘嘴鳜活饵组和饲料组肠道指标比较Tab.4 Comparison of intestinal indexes of S.chuatsi between the live bait group and compound feed group

2.3 配合饲料对翘嘴鳜肠道免疫酶指标的影响

翘嘴鳜活饵组和饲料组肠道的免疫指标变化如图3所示。饲料组和活饵组前肠、中肠和后肠的SOD活性均依次升高；CAT活性均在中肠中最低，后肠中最高；LYS活性后肠中最高，中肠中最低；补体C3含量中肠中最高，前肠中最低；lgM含量在饲料组前、中、后肠中接近，但活饵组前肠中最高，中、后肠较低。除前肠补体C3含量外，饲料组前、中、后肠5个免疫指标均低于活饵组，但差异不显著。

图3 翘嘴鳜活饵组和饲料组前、中、后肠免疫指标比较Fig.3 Comparison of immune indexes in the front，middle and hind gut of S.chuatsi between the live bait group and compound feed group

2.4 饲料对翘嘴鳜肠道炎性基因表达的影响

翘嘴鳜活饵组和饲料组肠道炎性基因相对表达量如图4所示。饲料组中肠IL-1β基因的相对表达量显著高于活饵组，前肠、后肠相对表达量显著低于活饵组；饲料组前、中、后肠TNF-α基因的相对表达量均显著低于活饵组，且前、中肠表现为差异极显著。饲料组前、中肠IL-10基因的表达量显著低于活饵组，后肠的表达量显著高于活饵组；饲料组前、中、后肠IL-4基因的相对表达量显著低于活饵组。

图4 翘嘴鳜活饵组和饲料组肠道不同部位免疫相关基因的相对表达量Fig.4 Relative expression of immune-related genes in different parts of intestine of S.chuatsi in the live bait group and compound feed group*：差异显著(P<0.05)；**：差异极显著(P<0.01)。

3 讨论

3.1 饲料对翘嘴鳜肠道组织结构的影响

肠绒毛是肠黏膜层和黏膜下层向肠腔内形成的突起结构，可增加肠道的内表面积，提高消化吸收效率[17]；肠道隐窝是由肠黏膜上皮向内凹陷到固有层形成的单管状腺，可向绒毛顶端补充新的细胞，维持肠绒毛结构和功能的完整性[18]。肠绒毛长度、隐窝深度、绒毛长度与隐窝深度比值均可直接反映出肠道的消化吸收能力[4]。本研究发现，翘嘴鳜饲料组肠绒毛长度显著降低，隐窝深度显著升高，肠绒毛长度与隐窝深度的比值显著降低，这表明摄食配合饲料后，翘嘴鳜肠道组织的完整性受到影响，可能引起肠道消化吸收功能下降。该结果与孙龙芳等[15]对鳜肠道的研究结果一致，在乌鳢[19]和大口黑鲈[4，20]研究中也发现类似现象。配合饲料会影响肉食性鱼类的肠道组织结构，这可能与配合饲料中含有植物蛋白质或其它营养、非营养成分，以及抗营养因子有关[21]。由于配合饲料与活饵间营养成分和性质的差异复杂，具体影响机制尚不清楚。

杯状细胞是一种黏液细胞，可分泌具有抵抗病原微生物入侵作用的黏蛋白，以保护上皮免受食物中有害生物或有害化合物的侵害[22]。本研究发现，翘嘴鳜饲料组肠道各部位的杯状细胞数目显著增加。翘嘴鳜饲料组肠道杯状细胞增生，可能是因为饲料损伤了肠绒毛结构，肠道通过增加杯状细胞的数量来增加黏蛋白的合成，从而保护肠道免受有害物质的侵害[23]。投喂配合饲料也会使大口黑鲈肠道杯状细胞数目增多[2]。

本研究结果显示，投喂配合饲料后，翘嘴鳜前、中肠黏膜受到的影响相对较大，肠绒毛长度明显缩短，内部细胞排列紊乱，这可能是因为饲料率先进入前、中肠，对其结构产生的影响较为直接，而对后肠的影响则相对较轻。

3.2 饲料对翘嘴鳜肠道免疫酶指标的影响

由肠上皮细胞产生的补体、淋巴细胞产生的溶菌酶和浆细胞产生的免疫球蛋白等共同组成机体肠道的免疫系统，与抗氧化系统共同抵御外界病原微生物的入侵[31]。本研究中，翘嘴鳜饲料组肠道LYS活性、C3、lgM含量均低于活饵组，但差异不显著，这表明配合饲料对翘嘴鳜肠道免疫功能产生了一定的影响。在其它鱼类研究中也发现类似现象，如配合饲料降低了珍珠龙胆石斑鱼肠道中LYS和C3水平和血清C4和IgM水平[32]。配合饲料降低鳜肠道免疫因子的水平，可能是由于配合饲料损伤了肠道组织结构，导致肠绒毛变短，肠上皮细胞数量和黏膜层中淋巴细胞数量减少，从而引起这些免疫指标的下降。

3.3 饲料对翘嘴鳜肠道炎性基因表达的影响

IL-1β和TNF-α是机体在病原体入侵时，由激活的巨噬细胞、淋巴细胞以及其它免疫细胞产生的促炎细胞因子，它们参与了调控免疫细胞增殖、分化和凋亡等过程[33，34]。IL-10是一种具有多种功能的免疫调节细胞因子，能有效防止肠道黏膜屏障的破坏和肠道炎症的发展[35]。IL-4与IL-10功能相互协同，平衡病原体的免疫反应和抑制炎症[36]。本研究结果显示，除个别炎性基因外，翘嘴鳜饲料组前肠、中肠和后肠的4个炎性基因相对表达量均显著低于活饵组，表明肠道免疫和抑制炎症的能力下降。分析原因可能是，饲料组肠绒毛结构受损，淋巴细胞的数量相对减少，从而引起肠道炎性基因的表达量显著降低。饲料组中肠抗炎基因IL-10和IL-4相对表达量的降低，加上促炎基因IL-1β的过量表达，表明饲料组中肠可能存在轻微炎症，这与LIU等[37]研究结果一致，低棉酚棉籽粕替代鱼粉会提高IL-1β基因和降低IL-10、IL-4基因的相对表达量，引发肠道炎症。同时，饲料组中肠杯状细胞最多，固有层有炎症细胞浸润，也可作为饲料组中肠发生轻微炎症的证据。IL-4可增强头肾细胞的吞噬活性，同时增加ROS产生和溶菌酶活性水平[38]，因此，饲料组肠道IL-4基因相对表达量的降低，可能是引起抗氧化酶和溶菌酶活性下降的重要原因。

4 结论

翘嘴鳜摄食配合饲料会对其肠道组织结构产生影响，突出表现在肠绒毛长度缩短、隐窝深度增加、杯状细胞分布密度增加。由此，引起了肠道组织抗氧化能力下降、非特异性免疫指标下降和炎性基因表达水平的下调，对肠道健康产生了不利影响。