基于AMPK/SREBP-1c通路探讨降糖三黄片防治2 型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的作用机制

黄尹滢， 迪娜·塔吾列， 卢伟炽 （指导：朱章志）

（1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）与2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）密切相关，两者患病率呈同步上升趋势。临床和流行病学调查研究表明，28% ～70%的T2DM 患者患有NAFLD[1]，与此同时发现大约有45%的NAFLD 患者罹患糖尿病[2]。胰岛素抵抗不仅是T2DM 发病的病理基础及关键环节[3]，还是“多重打击理论”中参与NAFLD 形成的重要一环。脂肪组织对胰岛素的抗脂解作用产生抵抗，导致外周脂解、游离脂肪酸向肝脏的输送增加，并推动脂肪再生[4-5]，引起肝脏脂肪的积累，最终导致NAFLD 的形成。临床上暂无针对T2DM 合并NAFLD 的特效药，因此，基于分子机制研究治疗T2DM 合并NAFLD 的方法，对临床上探寻其治疗的更多可能性具有重要意义。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是在真核细胞生物中广泛表达的异源三聚体蛋白，对糖代谢具有广泛的影响。甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）是由2 个基因编码的SREBP 转录因子家族的成员，在肝脏中能够激活糖酵解基因和参与脂肪生成的基因。作为AMPK的下游，SREBP-1c可以被AMPK 直接磷酸化，从而抑制其分裂和核易位[6]，进而减少肝细胞中脂质的积累。本课题组所研究的降糖三黄片，经多批次基础研究证实其具有减轻糖尿病鼠胰岛素抵抗、降糖调脂、抗氧化应激、改善肝功能等多种功效[7-9]。本研究通过观察降糖三黄片对AMPK/SREBP-1c 通路的影响，在前期研究基础上进一步深入探讨该药改善T2DM合并NAFLD的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级雄性SD 大鼠30 只，6 ～8 周龄，体质量180～210g，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0008。实验在广州中医药大学实验动物中心进行。动物实验通过广州中医药大学动物伦理委员会审定（批准编号：20221119001）。饲养条件：标准环境[温度（21±2）℃、湿度（45±10）%]，12 h/12 h光照黑暗循环，自由摄食饮水，每天换水、垫料。

1.2 药物降糖三黄片，广州中医药大学第一附属医院制剂中心生产，粤药制字：Z20071185，批号：20220301，规格：0.25 g/片，成人用量：8 ～10 片/次，一日3次；盐酸二甲双胍片（商品名：格华止），中美上海施贵宝制药有限公司生产，批号：国药准字H20023370，规格：0.5 g/片，成人用量：1片/次，一日3次。

1.3 试剂与仪器链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）；苏木精-伊红染液、油红O 染液（中山市奥博生物科技有限公司）；大鼠空腹胰岛素（FINS）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、甘油三酯（TG）定量检测试剂盒、总胆固醇（TC）定量试剂盒、谷草转氨酶（AST）活性检测试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）活性检测试剂盒、血浆游离脂肪酸（FFA）定量检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）/低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）定量试剂盒（美国Sigma 公司）；大鼠白细胞介素（IL）-6 、肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA 检测试剂盒（美国ThermoFisher 公司）；大鼠IL-1β ELISA 检测试剂盒（深圳子科生物科技有限公司）；AMPK 兔多抗、磷酸化AMPK（p-AMPK）兔单抗、SREBP-1c 兔多抗、β-actin 兔单抗（英国Abcam 公司）；辣根过氧化物酶（HRP）-山羊抗兔IgG 二抗（北京全式金生物技术有限公司）；低背景化学发光检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（日本TaKaRa 公司）。酶标仪（瑞士TECAN 公司）；光学显微镜（日本Nikon 公司）；WB 成像仪（美国ThermoFisher 公司）；电转仪、垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4 T2DM合并NAFLD大鼠模型的建立及分组大鼠适应性喂养1周后，采用随机抽样的方法选出6只作为空白对照组，用普通饲料喂养；余下大鼠作为造模组改用高糖高脂饲料喂养8 周。禁食不禁水12 h，高糖高脂饲料喂养大鼠按30 mg/kg剂量给予一次性腹腔注射STZ，空白对照组大鼠给予腹腔注射相同体积的柠檬酸缓冲液。注射STZ 72 h后从大鼠尾静脉采集血液，测定随机血糖水平，血糖＞16.7 mmol/L 者，提示造模成功[10-11]。将T2DM合并NAFLD 模型构建成功的大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、降糖三黄片低剂量组、降糖三黄片高剂量组，每组6只。

1.5 给药方法从实验第9 周开始，对各组大鼠进行灌胃。降糖三黄片低剂量组按成人临床等效剂量换算为大鼠量0.675 g·kg-1·d-1给药，降糖三黄片高剂量组按成人临床等效剂量4 倍换算为大鼠量2.7 g·kg-1·d-1给药，二甲双胍组按成人临床等效剂量换算为大鼠量0.2 g·kg-1·d-1给药[8]，空白对照组及模型组给予等体积生理盐水灌胃。每日1 次，持续4周。

1.6 观察指标与方法

1.6.1 大鼠一般情况观察 每周观察各组大鼠的精神、体质量、营养、活动、饮食等情况。每周测定一次大鼠的空腹血糖。

1.6.2 取材 药物干预4 周（实验第12 周）后取材，取材前禁食12 h。麻醉大鼠，经腹主动脉采血，离心得上清液，冷冻保存于-80 ℃冰箱。采血完成后，留取肝脏组织，经生理盐水反复冲洗后一部分行苏木素-伊红染色、油红O 染色，一部分留作Western Blot检测。

1.6.3 生化指标与炎症因子检测 检测血清FINS、TG、TC、LDL-C、HDL-C，AST、ALT、FFA，血清炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β 水平，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）。

1.6.4 肝组织形态学观察 取肝组织块修剪，脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚5 μm），展片，烤片。再进行脱蜡和水化。油红O染色：油红O乙醇染液染色8 min，50%乙醇分化，自来水终止分化。苏木素-伊红染色：苏木素染液染细胞核10 min，蒸馏水漂洗至不掉色，1%盐酸酒精分色液分色，自来水蓝化20 min，蒸馏水漂洗1 min；伊红染液中染色5 min，显微镜下观察染色情况。甘油明胶封片。光镜下观察肝小叶结构、肝细胞形态等病理学变化。

1.6.5 Western Blot法检测肝组织AMPK、p-AMPK、SREBP-1c 蛋白表达 裂解提取肝组织蛋白，用BCA 蛋白定量后，加热变性。按照蛋白定量的结果计算每个样品的上样体积，以保证上样量一致。将样品、PageRuler 预染蛋白Marker 依次加入不同的泳道，85 V 恒压电泳约30 min，转至125 V恒压电泳约1.5 h。按转印用滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，按照0.8mA/cm2通电转印1 h。用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，TBST 漂洗。加入稀释一抗包括AMPK 兔多抗（1∶2 000）、p-AMPK 兔单抗（1∶1 000）、SREBP-1c兔多抗（1∶2 000）、β-actin 兔单抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，TBST 漂洗。加入HRP-山羊抗兔IgG（1∶2 000），30 ℃孵育1 h，TBST 漂洗。按照化学发光检测试剂盒步骤将PVDF膜置于暗处显色30 s，用TBST终止反应，用WB成像仪扫描结果并记录。

1.7 统计方法采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，连续型变量以均数±标准差（±s）表示，非正态分布变量如HOMA-IR 取自然对数正态化后分析，血糖等重复观察指标的比较采用重复测量资料的方差分析，单次观察指标的比较采用单因素方差分析，多组间数据比较用方差检验。绘图软件使用Graphpad 软件。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较实验第12 周可见：正常组大鼠精神状况良好，性格活跃凶猛，毛发柔顺光亮，脂肪少，垫料干燥；模型组大鼠精神差，反应缓慢，性格温和，体型肥胖，皮下脂肪厚，毛发粗糙干枯，垫料潮湿，伴有多饮多食多尿等现象。与模型组比较，二甲双胍组、降糖三黄片低剂量组、降糖三黄片高剂量组大鼠均有相似表现，但多饮多食多尿程度降低，毛发较模型组光滑。

2.2 各组大鼠血清学指标比较

2.2.1 空腹血糖 表1 结果显示：实验干预前，造模组大鼠在8 周高糖高脂饲料喂养联合STZ 一次性腹腔注射72 h 后测得空腹血糖均＞16.7 mmol/L，且明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.001），判断T2DM 大鼠造模成功。实验干预3 周后，与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的空腹血糖明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），且二甲双胍组的空腹血糖下降幅度更明显；实验干预4周后，二甲双胍组和降糖三黄片高剂量组的空腹血糖进一步下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），而降糖三黄片高剂量组在调节空腹血糖方面，治疗效果与二甲双胍相当。

表1 各组大鼠空腹血糖比较Table 1 Comparison of fasting blood glucose among each group of rats（±s，mmol·L-1）

表1 各组大鼠空腹血糖比较Table 1 Comparison of fasting blood glucose among each group of rats（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白对照组比较；④P＜0.05，⑤P＜0.01，⑥P＜0.001，与模型组比较；⑦P＜0.05，与二甲双胍组比较

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2.2.2 糖耐量试验结果 图1、图2结果显示：糖耐量试验开始30 min 过后，各实验组的血糖水平均显著高于空白对照组。与空白对照组比较，其余实验组的AUC 均升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的AUC 均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与二甲双胍组比较，降糖三黄片高剂量组的AUC 值稍升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。表明降糖三黄片能有效控制T2DM 合并NAFLD 大鼠的餐后血糖，改善糖耐量，且高剂量组的效果优于低剂量组。

图1 各组大鼠糖耐量试验（OGTT）结果比较Figure 1 Comparison of oral glucose tolerance test results among each group of rats

图2 各组大鼠口服葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线下面积（AUC）比较（±s）Figure 2 Comparison of area under curve（AUC）of oral glucose tolerance test among each group of rats（±s）

2.2.3 血清空腹胰岛素（FINS）与胰岛素抵抗指数（HOMA-IR） 表2 结果显示：与空白对照组比较，其余实验组的血清FINS 均有所升高；与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的血清FINS 均有所下降，其中二甲双胍组和降糖三黄片高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。对于HOMA-IR，与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组均明显下降，差异有统计学意义（P＜0.001）；且相较于降糖三黄片低剂量组，降糖三黄片高剂量组的HOMA-IR 下降幅度更大，差异有统计学意义（P＜0.01）。二甲双胍组在改善HOMA-IR 方面更明显，但与降糖三黄片高剂量组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明降糖三黄片可以明显改善T2DM 合并NAFLD 大鼠胰岛素抵抗，减轻由于胰岛素抵抗导致的血清FINS升高。

表2 各组大鼠空腹胰岛素（FINS）及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较Table 2 Comparison of fasting insulin and insulin resistance indix among each group of rats（±s）

表2 各组大鼠空腹胰岛素（FINS）及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）比较Table 2 Comparison of fasting insulin and insulin resistance indix among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白对照组比较；④P＜0.05，⑤P＜0.01，⑥P＜0.001，与模型组比较；⑦P＜0.05，⑧P＜0.01，与二甲双胍组比较；⑨P＜0.01，与降糖三黄片低剂量组比较

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2.2.4 血脂代谢及游离脂肪酸（FFA） 表3 结果显示，与模型组比较，其余实验组的TC、TG、LDL-C、FFA 含量均明显下降，HDL-C 有所升高，其中：二甲双胍组的TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01 或P＜0.001）；降糖三黄片高剂量组的TG、LDL-C、HDL-C 与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.001）。在TG、LDL-C 的改善方面，降糖三黄片高剂量组下降幅度更大，但与二甲双胍组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示：二甲双胍和降糖三黄片均可改善T2DM 合并NAFLD大鼠的血脂代谢，降低体内的FFA，两者对不同的指标各有优点，但差异不大；随着降糖三黄片剂量的提高，降脂效果更好。

表3 各组大鼠血脂、游离脂肪酸（FFA）水平比较Table 3 Comparison of serum lipids and free fatty acids among each group of rats（±s，mmol·L-1）

表3 各组大鼠血脂、游离脂肪酸（FFA）水平比较Table 3 Comparison of serum lipids and free fatty acids among each group of rats（±s，mmol·L-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白对照组比较；④P＜0.01，⑤P＜0.001，与模型组比较；⑥P＜0.05，⑦P＜0.001，与二甲双胍组比较；⑧P＜0.05，⑨P＜0.01，⑩P＜0.001，与降糖三黄片低剂量组比较

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2.2.5 肝功能指标 表4 结果显示：与空白对照组比较，其余实验组的ALT、AST水平均有明显升高；与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的ALT、AST水平均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），二甲双胍组的下降幅度更大；但与二甲双胍组比较，降糖三黄片高剂量组ALT、AST水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，T2DM 合并NAFLD大鼠与正常大鼠相比，肝功能会受到明显影响，但二甲双胍和降糖三黄片均可在一定程度上改善T2DM 合并NAFLD 大鼠肝功能，减轻肝细胞的损害，且高剂量降糖三黄片在改善肝代谢方面与二甲双胍效果相当。

表4 各组大鼠肝功能比较Table 4 Comparison of liver function among each group of rats（±s，U·L-1）

表4 各组大鼠肝功能比较Table 4 Comparison of liver function among each group of rats（±s，U·L-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白对照组比较；④P＜0.05，⑤P＜0.01，⑥P＜0.001，与模型组比较；⑦P＜0.05，与二甲双胍组比较

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2.2.6 炎症因子指标 表5 结果显示：与空白对照组比较，其余实验组的IL-6、TNF-α、IL-1β水平均有所升高；与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的IL-6、TNF-α、IL-1β水平均有所下降，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），其中二甲双胍组的下降幅度更大；但与二甲双胍组比较，降糖三黄片高剂量组IL-6、TNF-α、IL-1β 的差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，T2DM 合并NAFLD 大鼠体内炎症反应明显，IL-6、TNF-α、IL-1β 均处于较高水平，使用二甲双胍和降糖三黄片后均可减轻大鼠体内的炎症反应。

表5 各组大鼠炎症因子水平比较Table 5 Comparison of inflammatory factors among each group of rats（±s，pg·mL-1）

表5 各组大鼠炎症因子水平比较Table 5 Comparison of inflammatory factors among each group of rats（±s，pg·mL-1）

注：①P＜0.05，②P＜0.001，与空白对照组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，⑤P＜0.001，与模型组比较；⑥P＜0.01，与二甲双胍组比较

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2.3 各组大鼠肝组织通路蛋白指标比较图3、表6 结果显示：与空白对照组比较，模型组的AMPK、SREBP-1c表达水平均有所升高，p-AMPK表达水平有所下降（P＜0.01 或P＜0.001）。与模型组比较，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的p-AMPK 表达水平均显著上升（P＜0.001），SREBP-1c 表达水平均显著下降（P＜0.001）；与二甲双胍组比较，降糖三黄片高剂量组的SREBP-1c表达水平降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。可见，T2DM合并NAFLD大鼠体内AMPK蛋白表达水平明显升高，磷酸化水平明显减弱，促进了SREBP-1c 的表达，导致脂质合成，而降糖三黄片及二甲双胍可以改善此情况。

图3 各组大鼠AMPK、p-AMPK、SREBP-1c蛋白电泳条带（Western Blot法）Figure 3 Protein electrophoretic bands of AMPK，p-AMPK，SREBP-1c（Western Blot）

表6 各组大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、SREBP-1c蛋白相对表达量比较Table 6 Comparison of the relative protein expressions of AMPK，p-AMPK and SREBP-1c in liver tissue among each group of rats（±s）

表6 各组大鼠肝组织AMPK、p-AMPK、SREBP-1c蛋白相对表达量比较Table 6 Comparison of the relative protein expressions of AMPK，p-AMPK and SREBP-1c in liver tissue among each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，与空白对照组比较；④P＜0.05，⑤P＜0.001，与模型组比较；⑥P＜0.05，与二甲双胍组比较；⑦P＜0.01，⑧P＜0.001，与降糖三黄片低剂量组比较

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2.4 各组大鼠病理学分析结果比较

2.4.1 HE 染色 图4结果显示：空白对照组大鼠肝组织结构完整，肝小叶结构正常，细胞未见肿胀，形态大小均匀一致；模型组大鼠肝脏组织肝小叶结构明显紊乱，可见肝细胞索模糊，肝窦消失，肝细胞高度气球样变，肝细胞内可见大量大泡性脂滴空泡，为重度脂肪肝改变。经过用药治疗，二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组肝小叶结构、肝细胞肿胀程度和脂肪变性都较模型组明显好转，其中二甲双胍组的肝细胞变性程度最轻。

图4 各组大鼠肝脏HE染色结果比较Figure 4 Comparison of liver HE staining results among each group of rats

2.4.2 油红O 染色 图5 结果显示：与空白对照组比较，模型组大鼠大量肝脏细胞浆内可见脂滴存在，细胞间也可见明显脂质染色；二甲双胍组及降糖三黄片低、高剂量组的胞浆内脂滴分布较模型组减少，细胞间脂质染色也明显减轻；二甲双胍组细胞间脂质沉积改善最明显，但胞浆可见散在小脂滴存在，降糖三黄片低、高剂量组胞浆内脂滴分布较二甲双胍组更少，但细胞间脂质蓄积的改善效果不如二甲双胍组。

图5 各组肝脏油红O染色结果比较Figure 5 Comparison of liver oil red O staining results among each group of rats

3 讨论

2 型糖尿病（T2DM）合并非酒精性脂肪肝（NAFLD）已成为一个重要的公共卫生问题，作为代谢性疾病，近几年其患者数呈现出明显的增长趋势，不少针对其发病的病理生理机制研究已获得较大的进展。但是，临床上对NAFLD 的治疗仍然是以改变生活方式和调整饮食结构为主，在快节奏的社会生活中有一部分人很难长期坚持这种方法，通过药物进行辅助治疗正成为越来越多人的选择，因此，研究出更多能有效地治疗T2DM 合并NAFLD 的药物已成为当前一项拥有广大前景的工作。本研究对比观察了降糖三黄片与二甲双胍对T2DM 合并NAFLD 的SD 大鼠中血糖、胰岛素抵抗、脂代谢、炎症指标、肝脏病理的影响。本研究以高脂高热量饲料诱导加STZ 注射所复制的T2DM 合并NAFLD 大鼠模型，具有明显的胰岛素抵抗和糖脂紊乱表现，病理检查显示与正常组比较有显著性差异，提示成功构建了符合T2DM 合并NAFLD的大鼠模型。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）由α、β 和γ 三个亚基所组成，其中α亚基决定了蛋白激酶复合物的活性，AMPK 通过α 亚基影响蛋白质和基因水平[12]的代谢途径。β 和γ 亚基是调控亚基，它们也参与了蛋白激酶复合物活性的调节[13]。每个亚单位在生物体中都有多种亚型，这些亚型的结合产生了12 种不同的AMPK 全酶变体，多样的异构体组成表明AMPK 具有多种细胞功能、组织特异性和亚细胞定位。AMPK的一个主要功能是监测ATP水平的变化，并将其与下游底物的磷酸化相结合，从而导致ATP 产生途径的速率增加或ATP 利用途径的速率降低。能量平衡失调被认为是导致一系列人类疾病变化的重要因素，如T2DM、肥胖和癌症。AMPK 在维持能量平衡方面的核心作用使其成为预防和治疗代谢性疾病（包括癌症）的药物的一个有吸引力的靶点[14-16]。

AMPK 对糖代谢具有广泛的影响，在促进葡萄糖转运、加强糖酵解以及抑制糖异生等生化反应中均发挥重要作用。研究[17]发现，糖尿病大鼠表现出脂质积累和胰岛素抵抗，而通过利古司汀增强AMPK 磷酸化，可介导糖尿病大鼠胰岛素敏感性。因此，AMPK 信号激活可被认为是糖尿病治疗中的一种保护机制[18]。NAFLD 是无法氧化或清除的沉积在肝脏中的脂质过量生产的累积结果，通过多种机制激活，AMPK 可抵消这些影响。有研究[19]表明，红景天苷通过诱导AMPK 信号通路显著降低TXNIP 及其下游NLRP3 炎症小体的表达水平，对高脂诱导的NAFLD 起保护作用，亦可减少肥胖，改变血糖水平和脂质积累，增强胰岛素敏感性，有利于减轻糖尿病的氧化应激和炎症反应。AMPK诱导的自噬在NAFLD 治疗机制中也很有研究意义，研究[20]发现，犬尿喹啉酸能够通过上调AMPK刺激自噬减轻NAFLD。

甾醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）在肝脏、脂肪组织、肾上腺和大脑中呈高表达。在肝脏中，SREBP-1c 激活糖酵解基因、葡萄糖激酶（GK）和参与脂肪酸合成（脂肪生成）的基因，调节参与大量肝细胞过程的基因，如细胞增殖、凋亡、炎症、细胞内膜靶向、细胞呼吸或RNA 处理[21-23]。SREBP-1c 参与肝脏甘油三酯合成[24]。研究[6]表明，AMPK 是SREBP-1c 的上游，可以通过磷酸化转录因子SREBP-1c，阻止其蛋白水解加工，抑制其转位到细胞核，下调脂肪生成基因的转录，包括编码ACC 和脂肪酸合酶的基因。Kohjima 等[25]发现，在T2DM 的胰岛素抵抗状态下，胰岛素仍然可以激活SREBP-1c，SREBP-1c的过度表达，可以直接通过抑制胰岛素受体底物2基因转录加重胰岛素抵抗。Chu 等[26]研究发现，通过小干扰RNA 下调SREBP-1c 的表达，可以减少肝脏中硬脂酸合成和血清硬脂酸水平，进而改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗。

本研究团队已对降糖三黄片在糖脂代谢紊乱方面的作用进行了大量前期研究，发现降糖三黄片在临床及动物实验中均能有效降低血脂水平[8，27-30]。本研究结果显示，T2DM 合并NAFLD 大鼠存在明显的多饮多食多尿等现象，血糖升高，胰岛素抵抗明显，血脂水平明显升高，肝酶升高，炎症反应增强，病理上可见肝细胞有明显的脂质蓄积及细胞结构异常。通过与西药二甲双胍作对照，结果表明，降糖三黄片可以有效降低T2DM 合并NAFLD 大鼠的血糖、血脂水平，减轻胰岛素抵抗，还能减轻炎症反应，减轻对肝功能的损害，减少肝细胞的结构变性及脂质蓄积。而高剂量的降糖三黄片对T2DM 合并NAFLD 的SD 大鼠的糖脂代谢、胰岛素抵抗、肝功能、炎症因子、肝脏病理等方面的改善作用均较低剂量明显，且与西药二甲双胍相仿。通过Western Blot 法检测肝脏AMPK、p-AMPK、SREBP-1c 蛋白表达，发现降糖三黄片降低了T2DM 合并NAFLD 大鼠AMPK 蛋白的表达水平，促进了AMPK 的磷酸化，减少了SREBP-1c 的过表达，且高剂量作用效果明显优于低剂量，但未显示出明显的量效关系，高剂量疗效与西药二甲双胍无显著性差别。由此我们推测，降糖三黄片通过AMPK-SREBP-1c途径减少了过度营养诱导的肝脏TG 蓄积。降糖三黄片促进AMPK 的磷酸化，AMPK 磷酸化的增加促进了SREBP-1c 的磷酸化，从而抑制了SREBP-1c的切割和核转位，从而导致脂肪生成和脂质积聚减少，进而提高胰岛素敏感性，改善肝脏代谢，对T2DM 合并NAFLD起到防治作用。

对于T2DM 合并NAFLD 这一疾病，古代医家存在从肝论治消渴的理论，如《难经·五十六难》中认为肥气者多嗜肥甘厚腻，可转为消渴，亦可见右胁肋部不适等肝积之症。现代医家对于T2DM合并NAFLD 患者的病因病机有不少的研究，如范译丹等[31]认为该病会导致气机运行不畅，郁热、津伤进一步加重，进而相互影响形成恶性循环。史丽伟等[32]则认为当机体内存在肝郁脾虚，湿热内阻或痰瘀互结时，往往就会促成T2DM 合并NAFLD的发生。可见瘀、热之邪是T2DM 合并NAFLD 病程中的重要病理因素。降糖三黄片是广州中医药大学第一附属医院的纯中药院内制剂，由桃核承气汤化裁而来，该药由桃仁、大黄、芒硝、桂枝等中药组成，方中：桃仁苦甘平，活血破瘀，大黄苦寒，下瘀泻热，二者合用，瘀热并治；芒硝咸苦寒，泻热软坚，助大黄下瘀泻热；桂枝辛甘温，通行血脉，既助桃仁活血祛瘀，又防硝、黄寒凉凝血之弊[9]。应用降糖三黄片治疗T2DM 合并NAFLD，切合其病机。

综上所述，降糖三黄片可有效治疗T2DM 合并NAFLD大鼠，其作用机制可能与通过调节AMPKSREBP-1c 途径减少肝脏脂质蓄积，进而提高胰岛素敏感性，改善肝脏代谢有关。