酶联免疫吸附法检测乙肝表面抗原不同程度乳糜血对其的干扰分析*

张杰嫦，赖艳娥，刘运保，邓凯航，喻红玲，林雪珍，虢 娟，谢冬梅，黄勇华，张松英，廖丽梅，龚嘉聪

清远市中心血站，广东 清远 511518

血液是医院救治患者生命的关键点，因此，严格管理血液安全和质量对输血安全的防控具有重大意义。随着人们生活质量的提升，以及人们不良的生活习惯出现，乳糜血在无偿献血者血液中出现的比例逐渐增多，在我国为了保证献血者身体健康减少献血不良反应未对献血者献血前饮食情况加以限制，献血者往往是餐后献血，这就导致餐后乳糜微粒生理一过性增高，乳糜血中胆固醇、磷脂等物质含量偏高，致使血浆呈现乳白色或混浊状，进而无法用于临床输血或血液品制作。因此乳糜血被淘汰比率逐年增高。临床上，乳糜血会影响多项生化项目的检测，而关于乳糜血浆对酶联免疫吸附法（ELISA）检测的影响报道不多。本研究细化乳糜血浆的程度，于不同时间检测乙肝表面抗原（HBsAg），研究不同乳糜程度对HBsAg 检测结果的干扰，探讨乳糜血浆检测结果的可靠性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

广东省清远市中心血站于2018 年采集192 名无偿献血者血液，献血者均符合国家卫生部颁发的《献血者健康检查要求》（GB18467－2001），征得献血者知情同意并签署知情同意书。分离血浆，收集血浆192 袋，其中无乳糜血浆（乳糜指数为≤1）24袋，不同乳糜程度血浆168袋（乳糜指数2、3、4、5、6、8 及＞8 各24 袋）。无乳糜的乙肝表面抗原阳性血浆1 袋。所有实验用血浆均经病毒灭活处理。

1.2 试剂与仪器

HBsAg 试剂（北京万泰生物药业股份有限公司，批号N20180721），SEPAMATIC-SL（III）全自动血液成分分离机（德国普特公司），BSSD-III-01 速冻机（武汉贝索公司），Xantus 150 全自动加样系统（深圳爱康公司），BEPIII 全自动酶联免疫分析系统（德国西门子公司），快速混匀器（江苏新康公司），所有仪器经厂家检定合格，均在校准期内。乳糜测定仪：移动式乳糜测定仪（自主研发）等。

1.3 方法

向不同程度乳糜血浆加入等量的HBsAg 阳性血液，通过不同检测时间，对不同乳糜指数血浆，采用ELISA 检测HBsAg。操作按照产品说明书进行。

1.3.1 样本处理 从收集到的不同乳糜程度的192 袋乳糜血浆中准确吸取2 mL 血浆，加入2 mL HBsAg 阳性血清（S/CO=11.524），用混匀器充分混匀后作为测定管。

1.3.2 血浆乳糜指数确定 加入HBsAg 阳性血浆后造成原血浆乳糜程度变化，取1 mL 的混匀血浆按血液乳糜程度检测方法重新确定血浆乳糜指数。

1.3.3 离心血浆HBsAg 检测 混匀血浆经1 000～1 498 g离心20 min后，分层清晰，取无或少乳糜层的中下层血浆检测HBsAg。

1.3.4 在不同时间检测HBsAg 选取乳糜指数分别为≤1、2、4、5、6、8 及＞8 血浆各20 份，放置4℃冰箱，分别于第3 d、第5 d、第7 d、第10 d检测HBsAg。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计算均数的变异系数CV，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同程度乳糜血浆HBsAg检测结果

分别对不同程度乳糜指数≤1、2、3、4、5、6、8 及＞8血浆样本检测HBsAg，根据A值，计算X =S/CO，结果显示：单个样本之间的A 值差异大，应与乳糜血浆中的乙肝表面抗体含量高低有关，乳糜指数2 以上的血浆与无乳糜血浆之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），重度乳糜血浆比无乳糜血浆S/CO 值稍高，见表1。

表1 不同乳糜程度血浆HBsAg检测结果

2.2 不同时间检测乳糜血浆HBsA结果分析

乳糜指数分别为≤1、2、3、4、5、6、8 及＞8 血浆各20 份，放置4 ℃冰箱，分别于首次检测后的第3 d、第5 d、第7 d、第10 d，检测HBsAg。不同程度乳糜血浆放置不同时间，HBsAg检测结果有区别，乳糜指数≤3的乳糜血浆10 d 内检测差异无统计学意义（P＞0.05）；乳糜指数4、5、6、8 及>8 的乳糜血浆第3 d 及以后与第1 d 的检测结果差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同时间检测乳糜血浆HBsA结果分析（±s）

表2 不同时间检测乳糜血浆HBsA结果分析（±s）

乳糜指数≤1时间（d）t值1 5.919±1.244 5.347±0.924 5.351±1.005 5.356±1.352 5.946±0.945 6.804±0.768 6.618±0.595 6.782±0.875 3 5 7 t1，3 t1，5 t1，7 t1，10 2 3 4 5 6 8 ＞8 5.963±2.043 5.051±1.724 5.054±1.199 4.397±1.392 4.113±1.398 5.215±0.701 5.637±1.218 5.651±1.385 6.437±1.956 5.182±2.169 4.986±1.486 4.363±1.471 4.212±1.657 5.284±1.297 5.617±1.512 5.860±1.844 4.784±1.684 3.670±1.771 3.674±1.445 2.998±1.196 2.890±1.273 3.743±1.294 4.273±1.400 3.899±1.682 10 5.655±2.239 4.201±2.323 3.996±1.648 3.382±1.531 3.251±1.582 4.491±1.513 4.817±1.640 5.274±1.889 0.067 1.016 1.446 3.107 3.815 3.297 2.952 4.592 0.854 0.383 1.438 2.982 2.901 4.848 2.512 2.461 2.08 5.069 6.289 6.704 7.034 9.097 6.072 6.305 0.386 2.405 4.390 4.834 4.984 5.940 3.998 3.664

3 讨论

血液检测结果受诸多因素的影响，献血人群、献血前筛查、血液检测实验室的质量水平都可能对检测结果造成影响。ELISA 检测主要通过三联吡啶钌与蛋白质、半抗原激素、核酸等化合物进行结合，其免疫检验期间不受外来光源干扰，消除了光散射、噪音干扰，是HBV标志物的检验金标准[1]，但HBV 感染窗口期等会对其检测结果造成干扰，增加漏诊风险[2]。随着酶免法检测技术不断完善，ELISA 也是医院临床及血液中心，中心血站常用免疫学检测技术，它具有灵敏、 简便、快速、载体易标准化等多种优点，在血液筛查中应用广泛[3]，其在血HBsAg、抗HCV、抗HIV 和梅毒抗体检测中发挥着重要的作用。无偿献血是自愿者将血液无私奉献的一种大爱行为，在挽救患者人生命医疗救治工作中起到重要意义，为应急事件用血需求和安全提供重要保障[4]。血液报废不仅是一种浪费，也是对献血者献血动力的打击。街头无偿献血人群具有较高乳糜血发生率，且乳糜血发生与献血者性别、年龄、BMI、职业、献血时间及献血次数等有关，应加强对乳糜血高发人群献血知识宣教工作[5]。单位团体献血的不合格率最低（3.60%）、街头个人献血最高（4.91%），其他兄弟血站也有类似报道[6]，及时发现不符合献血要求的献血者，建议延期献血避免血液浪费，加大无偿献血宣传力度，针对性地加强不同性别、年龄、体重的无偿献血者的宣传教育，让献血者了解献血前进食高蛋白饮食（如动物脂肪、牛奶、鸡蛋、豆制品），对血液安全及质量的影响。对献血工作者从源头抓起，避免乳糜血的采集。调查显示1 010 名无偿献血者其中146 例为不同程度乳糜血，占总人数的14.5%，因中重度乳糜而被淘汰人数占4.8%[7]。乳糜血内含有较多量的微小颗粒，在输注时可能引起微血管堵塞。另外，乳糜血标本会直接或间接影响血液检测结果[8]，如果输注重度乳糜血，里面的乳糜微粒可能引起受血者微血管的脂肪栓塞，或者过敏发热等输血不良反应，也会使血液检查结果偏离[9]。乳糜血浆与无乳糜血浆之间的S/CO 值比较无显著差异，重度乳糜血浆比无乳糜血浆S/CO 值稍高，分析检测结果偏高的原因，乳糜血浆中的脂溶性CM 附着在ELISA 试剂聚苯乙烯板孔表面，影响了洗板效果，增加游离酶标记物质的残留量，导致乳糜血相应的S/CO 值偏高[10]。查看相关文献，有关乳糜血浆对ELISA 法的影响众说不一[11-12]。根据项目结果统计可知，不同程度乳糜血浆对HBsAg检测无影响，这与夏兵的报道是一致的[13]，一项研究采用分离乳糜血浆组与原血浆组的比较，其中一种试剂无显著差异[14]，也可说与本文结果相一致的。一项研究用高速离心法对比重度脂标本对ELISA 的影响，结论是高速离心前后无显著性差异[15]。在实际工作中，因加样器的设计是探测液面即吸样，如遇到明显分层的乳糜血浆，为了保证检测结果的可靠性，必须先手工分离乳糜层。应用滤器过滤法和高速离心法可以有效处理去除脂肪血浆中的乳糜微粒，4 ℃倒置冷藏法处理脂肪血浆能力有限，脂肪血浆经适当处理后可以提高其质控达标符合率[16]，消除脂血的最佳方式为高速离心法，能够有效提升生化检验准确性，为临床诊断及治疗方案的制定提供更加精准的参照指标[17]。

乳糜指数2 及以上的乳糜血浆在第7 d 的检测结果与第1 d 比较均有统计学意义，增加室温放置时间能增高A值，从而增大S/CO 值，分析其原因，有可能随着反应时间的增长，增加了微孔包被的HBsAb与血浆中HBsAg的结合反应。检测过程的改变会导致的检测结果变化，在同等条件下，乳糜血浆与无乳糜血浆相比较，乳糜血浆受影响更明显。乳糜指数2 和3 的乳糜血浆10 d 内检测无统计学意义，第10 d 与第1 d 的差异具有统计学意义；乳糜指数4、5、6、8及＞8的乳糜血浆在第3 d的检测结果与第1 d比较差异有统计学意义，不同乳糜程度血浆放置时间不同，TP-Ab 检测结果有差异：放置时间延长，检测结果升高[18]。因此联想到实际工作中，标本检测一般都会在3 d内完成，但复查标本因各种原因有可能3 d 内没完成的，以后工作中对于中度、重度乳糜血浆必须在3 d 内完成检测，以保证血液检测的质量。这与刘运保[19]的研究观点基本相符合。综上所述，血液中心及血站等采供血机构必须加强无偿献血宣传力度，让献血者了解献血前后注意事项，有针对性地对存在危险因素群体进行初筛及征询，避免不合格血液的采集，保障血液安全的基础上避免血液的浪费，降低乳糜血报废率，精益求精保证血液安全质量。