Hedgehog信号通路在肝细胞癌发生发展中作用的研究进展

韦丽军，潘丽英，黄赞松，钟国强，林岩

1 右江民族医学院附属医院消化内科 广西肝胆疾病临床医学研究中心，广西百色533000；2 右江民族医学院研究生学院

肝癌是全球第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因。肝细胞癌（HCC）是肝癌最常见的病理类型，占75%～85%［1］。HCC起病隐匿，早期症状不典型，大多数患者确诊时已处于中晚期，通常失去了手术治疗的机会，只能采取姑息性治疗，但其长期疗效并不能令人满意［2］。迄今为止，HCC发病的机制分子仍不十分清楚，普遍认为与多种信号通路的异常激活或抑制有关［3-5］，如MAPK、Notch、Wnt、PI3K/AKT/mTOR、Hedgehog等信号通路。以往对于Hedgehog信号通路的研究较少，近年随着研究不断深入，Hedgehog信号通路在HCC中的作用逐渐被揭示。Hedgehog基因最初在果蝇的突变基因筛选中被发现，其在进化上高度保守。Hedgehog信号通路是胚胎发育分化所必需的，在胚胎发育早期处于激活状态，但当组织器官发育成熟后，该信号通路从激活状态逐渐转变为失活状态［6］。近年研究发现，在多种恶性肿瘤中Hedgehog信号通路异常激活，其异常激活能够促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和多药耐药［7］。邵香香等［8］研究认为，Hedgehog信号通路激活是胚胎肝细胞分化、增殖和极性所必需的，并在HCC的发生、发展中发挥重要作用。本文结合文献就Hedgehog信号通路在HCC发生、发展中作用的研究进展作一综述。

1.edgehog信号通路概述

1.1.edgehog信号通路组成 Hedgehog基因最初是在筛选果蝇的突变基因时被发现的，该基因突变会导致果蝇胚胎呈多刺小球状，如同刺猬一般，故名“Hedgehog”［9］。Hedgehog信号通路是胚胎发育分化的重要通路［9］，主要由分泌型糖蛋白配体Hh、跨膜蛋白受体Ptch、跨膜蛋白Smo、核转录因子Gli、类运动蛋白Cos2、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Fu和抑制因子Sufu等组成。目前，在哺乳动物中发现了3种Hedgehog同源基因，分别为SHH、IHH、DHH。这些同源基因虽然生理作用相似，但在胚胎发育分化中的作用不同。SHH可参与胚胎器官发育，如大脑、脊柱、中轴骨骼和四肢的形成等；IHH对软骨生长板发育和调节至关重要；DHH主要负责雄性性腺分化和神经外膜发育［10］。SHH是目前研究最深入的配体，作为细胞间的信号因子，可通过自分泌或旁分泌机制调控细胞命运。

1.2.edgehog信号通路功能 在Hh缺失的情况下，Ptch可抑制Smo活性，从而抑制下游信号通路，这时信号通路下游的Gli与胞质蛋白结合，阻止Gli进入细胞核，从而抑制下游靶基因的转录。当Hedgehog信号通路活化后，Hh与Ptch结合导致Ptch失活并解除对Smo的抑制作用，活化的Smo将Hedgehog激活信号传递到细胞质中，最终通过Sufu将Gli从细胞质中释放出来，从而使Gli转运到细胞核，通过结合转录靶点而调节靶基因的表达。Ptch作为一种12次跨膜蛋白，既是Hh配体的受体，也是Smo的阻遏物。在哺乳动物中有两种Ptch的同源物，即Ptch1、Ptch2。Smo是一种与G蛋白偶联受体同源的7次跨膜蛋白，也是Hedgehog信号传递所必需的受体，通常被Ptch抑制。Gli家族是一类多功能转录因子，属于C2 H2型锌指结构蛋白。在Hedgehog信号通路中，Gli1作为转录激活因子，而Gli2、Gli3既可作为转录激活因子又可作为转录抑制因子［11］。Gli是Hedgehog信号通路末端的核执行因子，负责调控下游靶基因。Sufu是Hedgehog信号通路的负性调节因子，通过与Gli结合，阻止Gli进入细胞核，也可在细胞核内辅助其他蛋白抑制Gli活性，从而负反馈调控Hedgehog信号通路。参与Hedgehog信号转导的核内因子包括Ci/Gli、Fu、Sufu、Cos2、蛋白激酶A（PKA）等。其中，Hh、Smo、Ci/Gli、Fu起正调控作用，Ptch、Cos2、PKA起负调控作用。

Hedgehog信号通路在人体各种组织中广泛存在，但该信号通路激活受到严格调控，通过正负反馈调节靶基因的表达，从而形成复杂的调控网络。在肿瘤的发生、发展中，Hedgehog信号通路的激活途径有经典型和非经典型两种。经典型Hedgehog信号通路包括Hh配体（SHH、IHH、DHH）、Ptch受体（Ptch1、Ptch2）、Smo受体、Sufu和Gli转录因子（Gli1、Gli2、Gli3）。Hedgehog信号传递受靶细胞膜上Ptch、Smo两种受体控制。在无Hh配体和Ptch受体的情况下，Smo激活可导致Hedgehog靶基因的活化；Smo基因突变时，可出现与Hh基因突变相同的表征。在Hedgehog信号通路存在的情况下，Hh与Ptch结合导致Ptch失活并解除对Smo的抑制作用，具有活性的Smo将Hedgehog激活信号传递到细胞质中，最终通过Sufu将Gli从细胞质中释放出来，从而使Gli转运到细胞核，通过结合转录靶点而调节靶基因的表达。相反，在缺乏Hh配体的情况下，Ptch抑制Smo从而导致下游基因的失活。非经典型Hedgehog信号通路分为三种类型：Ⅰ型是Ptch介导的Hedgehog信号通路，不依赖于下游Smo/Gli，进一步又分为两个亚型：ⅠA和ⅠB型，其中ⅠA型是Ptch介导的不依赖于下游Smo/Gli的细胞凋亡、ⅠB型是一种Ptch介导的不依赖于Smo/Gli的细胞周期调控；Ⅱ型是Smo介导的Hedgehog信号通路；Ⅲ型是Gli介导Hedgehog信号通路，不依赖于Gli的任何上游信号。目前，对于非经典型Hedgehog信号通路的作用机制仍不十分清楚。事实上，非经典型Hedgehog信号通路似乎是经典型Hedgehog信号通路不起作用时的一条备用通路。此外，非经典型Hedgehog信号通路似乎是细胞毒性或炎症应激下机体利用的一种逃逸方式［11］。

2.edgehog信号通路在HCC发生、发展中的作用

Hedgehog信号通路在正常细胞的生长、分化中发挥关键调控作用，一旦某一基因成分发生突变或异常，Hedgehog信号通路就会被激活。当Hedgehog信号通路激活时，Hh与Ptch结合解除了Ptch对Smo的抑制作用，Smo进入细胞质并激活下游转录因子Gli，从而诱导目的基因的表达，进而调控细胞生长、增殖和分化。在成人健康肝细胞中几乎不表达Hh配体，而在酒精中毒、脂肪变性、胆汁淤积或病毒感染等慢性损伤时，肝细胞会产生Hh配体激活Hedgehog信号通路。SICKLICK等［12］研究表明，与非肿瘤细胞相比，肿瘤细胞Smo过表达并激活了Hedgehog信号通路。国内罗小军等［13］研究发现，SHH和Gli2在HCC细胞系（HepG2、Huh7）和HCC组织中高表达。这些研究结果证实，Hedgehog信号通路激活能够参与HCC的发生、发展。

2.1.控肿瘤细胞增殖 恶性增殖是肿瘤细胞的特征之一。在脊椎动物中，SHH与Ptch1结合解除了对信号转导蛋白和Smo的抑制作用，然后传递Hedgehog信号以激活下游蛋白，诱导目的基因的表达。Gli2不仅能调节与细胞增殖直接相关的基因转录，如MYC、CCND1/2、CCNB1和CCNE，还能调节编码转录因子的基因表达，如FOXM1。FOXM1可调节细胞周期蛋白表达。TPX2是一种促癌基因，是FOXM1的直接下游靶点。WANG等［14］研究报道，抑制Hedgehog信号通路可下调TPX2表达，从而减轻SHH诱导的HCC细胞增殖；敲低FOXM1，TPX2表达会降低，HCC细胞生长受到抑制。由此推测，FOXM1可能通过靶向调控TPX2表达驱动HCC细胞增殖。此外，有研究发现，通过选择性Smo抑制剂抑制Hedgehog信号通路，可诱导DNA合成减少，显著降低HCC细胞的增殖、侵袭和迁移，并且其抑制作用呈剂量和时间依赖性［15］。

在我国，乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致HCC发生的主要原因。HBV X基因编码的HBx蛋白在HBV相关HCC中发挥重要作用。作为一种多功能的反式激活蛋白，HBx不仅可改变抑癌基因的表型而介导HCC细胞形成，还可促进HCC细胞增殖并抑制其凋亡［16］。已有研究证实，HBx不仅能诱导SHH、Ptch1和Gli2产生，还能直接与Gli1作用，增加Hh靶基因的反式激活，从而促进HCC的发生、发展［17］。研究表明，表达HBx蛋白的转基因（HBxTg）小鼠在5～6月龄时出现肝炎和脂肪变性，8～9月龄时出现增生性结节，12月龄时100%出现HCC［18］。随着鼠龄增长，HBxTg小鼠HBx、Gli2、SHH表达均有所增加。HBxTg小鼠经Smo抑制剂Vismodegib（GDC-0449）治疗后Gli2、SHH表达下调，肿瘤生长明显受到抑制［18］。

越来越多证据表明，非编码RNA与HCC的发生、发展密切相关，如miRNA、circRNA［19］。LI等［20］研究报道，上调miR-132表达可抑制SHH表达，从而抑制HCC细胞增殖并诱导其凋亡。除此之外，circ-0036412被发现可通过Hedgehog信号通路促进HCC细胞增殖并阻遏细胞周期进程［21］。以上研究表明，Hedgehog信号通路可通过多种机制调控HCC细胞的增殖、凋亡、迁移等生物学过程。

2.2.控肿瘤细胞侵袭和迁移 恶性肿瘤具有侵袭性和转移性特征。上皮间质转化（EMT）在恶性肿瘤细胞的黏附、侵袭和迁移中具有重要作用。EMT的重要特征是上皮标志物（如E-cadherin）表达降低或缺失和间充质标志物（如N-cadherin、Vimentin、波形蛋白）表达增加。有研究表明，CCL2可通过激活Hedgehog信号通路诱导HCC细胞侵袭和EMT。HCC细胞经Smo抑制剂处理，E-cadherin表达上调，Snail、Vimentin表达下调，从而降低了HCC细胞的侵袭能力；Gli1下调可阻断CCL2诱导的Snail、Vimentin表达上调和E-cadherin表达下调［22］。许秋然等［23］研究亦发现，Gli1表达与Vimentin表达呈正相关关系，与E-cadherin表达呈负相关关系，表明Hedgehog信号通路可诱导与HCC细胞侵袭和迁移相关的EMT过程。Snail是一种编码具有锌指结构的转录因子，参与多种肿瘤细胞EMT后获得侵袭和迁移能力。YANG等［24］研究发现，Snail不仅可通过下调E-cadherin表达降低细胞黏附力，还可通过上调MMP-2、MMP-9表达诱发HCC细胞EMT并促进其侵袭和迁移。MMPs属于锌依赖性内肽酶家族，几乎能降解所有的细胞外基质成分，在恶性肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。有研究报道，SHH信号可通过激活PI3K/AKT、FAK/AKT信号通路上调MMP-2、MMP-9表达，诱导HCC细胞的侵袭和迁移［25］。Hedgehog信号通路能够促进肿瘤细胞EMT表型和上调MMPs表达，从而促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。

2.3.控肿瘤细胞自噬 自噬是一种保守的分解代谢过程，负责清除受损的细胞器或错误折叠的蛋白质，以维持细胞内稳态。自噬功能障碍与多种疾病密切相关，尤其是在恶性肿瘤发生、发展和治疗耐药中具有关键作用。有研究报道，与正常肝组织相比，HCC组织自噬程度增强；此外，HCC细胞对周围组织的侵袭与其细胞内更高水平的自噬程度有关［26］。有研究报道，在肝星状细胞LX-2中，Gli抑制剂GANT61抑制Hedgehog信号通路可诱导自噬，除可减轻肝纤维化外，还可改善肺和肾纤维化；除此之外，GANT61激活自噬可诱导细胞凋亡并抑制其增殖［27］。LIU等［28］研究发现，抑制Hedgehog信号传导可诱导肝星状细胞自噬。Smo抑制剂环巴胺或Ptch1/Gli1 siRNA抑制Hedgehog信号通路可诱导自噬增强。而嘌呤胺刺激Hedgehog信号通路可降低自噬，证实Hedgehog信号通路对肝星状细胞自噬具有负性调控作用。WANG等［29］研究证实，GANT61通过抑制Hedgehog信号通路诱导自噬增强，而Hh配体或Hh激动剂通过激活Hedgehog信号通路而阻止其诱导自噬增强。抑制GANT61诱导的自噬可阻碍GANT61诱导的细胞凋亡、细胞毒性和肿瘤抑制作用，表明GANT61诱导的自噬对HCC细胞具有杀伤作用。此外，使用GANT61处理癌细胞发现，Gli1、Gli2和Ptch1 mRNA表达降低，并且其效果与剂量有关，Hedgehog信号的阻断抑制了癌细胞的恶性增殖和克隆形成［30］。SQSTM1是一种致癌基因，其编码蛋白为p62。p62是一种多功能蛋白，可作为蛋白接头诱导自噬进而导致特定靶蛋白降解。GANT61或环巴胺可诱导SQSTM1/p62、LC3-Ⅱ积累，LC3-Ⅱ是自噬标志物之一，但Hh抑制剂不会影响自噬相关基因的表达；Hh激动剂通过激活Hedgehog信号通路降低自噬程度，从而抑制HCC细胞的增殖［30］。这表明Hedgehog信号通路可通过调节自噬活性，调控HCC细胞的增殖和凋亡。

2.4.响肿瘤微环境（TME） TME是肿瘤细胞存在的周围微环境，在肿瘤发生、发展中发挥重要的调控作用。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TME的重要组成部分，常被认为是肿瘤预后不良的生物标志物。TAMs有两种激活亚型：经典型（M1型）和替代型（M2型）。M1型激活可产生多种促炎症细胞因子，在病原菌耐药和肿瘤控制中发挥重要作用。M2型激活可释放大量免疫抑制性细胞因子，从而促进免疫抑制和肿瘤进展，并导致化疗耐药。TAMs常见于HCC间质中，能够极化为M2样表型。M2样TAMs在HCC中发挥免疫抑制作用，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等生物学过程［31］。Hedgehog信号传导可促进TAMs产生，从而导致免疫抑制。骨髓中的Smo不仅是HCC生长所必需的，也是M2极化所必须的，在HCC发生、发展中起重要作用［32］。缺氧通过将TAMs极化为M2表型，从而促进HCC细胞增殖并刺激肿瘤血管生成。缺氧还可激活HIF-1，而HIF-1可促进肿瘤血管生成、免疫逃逸等。有研究发现，在HCC组织中HIF-1α表达与Gli表达呈正相关关系，缺氧能够显著促进HCC细胞EMT，其机制与激活非经典型Hedgehog信号通路有关［33］。敲低HIF-1α表达可抑制缺氧诱导的Smo、Gli1表达，从而抑制HCC细胞EMT。使用Smo抑制剂或Gli1 siRNA可逆转缺氧条件下HCC细胞EMT［34］。激活Hedgehog信号通路能够影响TME，从而在HCC细胞的增殖、侵袭、迁移以及肿瘤血管生成中起关键作用。因此，进一步探索TME将为针对HCC的免疫治疗或靶向治疗提供新的方向。

3.edgehog信号通路在HCC治疗中的作用

越来越多证据表明，Hedgehog信号通路与HCC的发生、发展有关。因此，调控Hedgehog信号通路中的受体或转录因子有可能成为靶向治疗HCC的潜在策略。目前，Smo受体及其下游转录因子Gli已经作为靶点被用于抗HCC药物研发。天然抑制剂环巴胺可通过抑制Smo来阻断Hedgehog信号通路。有研究报道，环巴胺能够促进HCC细胞的凋亡，并抑制其生长和增殖［35］。与单纯放疗相比，环巴胺联合放疗能够明显缩小肿瘤体积［36］。因此，使用SHH抑制剂联合放疗可能会增加HCC细胞对放疗的敏感性。目前，靶向Smo受体的药物已被美国FDA批准用于治疗胰腺癌、乳腺癌、结肠癌等，如Vismodegib（GDC-0449）、Sonidegib（NVP-LDE225）和Saridegib（IPI-926）［17］。既往研究发现，环巴胺和Vismodegib均能抑制HCC生长［36］。GANT61是Gli的选择性抑制剂，能够显著抑制HCC细胞的增殖。在移植Huh7细胞的HCC异种移植模型中，GANT61能够抑制肿瘤形成和生长［37］。以上研究均提示，针对Hedgehog信号通路的靶向治疗有可能成为HCC新的治疗策略。

综上所述，Hedgehog信号通路是一条非常经典的细胞信号传导通路，在胚胎发育和组织维持、更新、再生过程中发挥关键作用；在HCC中Hedgehog信号通路异常激活，其异常激活可通过调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学行为，从而促进肿瘤的发生、发展，并且针对Hedgehog信号通路的靶向治疗有可能成为HCC新的治疗策略。