PKM2和ALDOA在胃癌中的表达与病理特征的相关性

周淑萍,盛晓曼

(1.安徽理工大学第一附属医院,安徽 淮南 232001;2.安徽理工大学医学院,安徽 淮南 232001)

胃癌(gastric cancer,GC)是中国最常见的恶性肿瘤之一。根据2020年的数据分析显示,在中国胃癌的发病率占所有癌症发病率的10%,仅次于肝癌和结直肠癌;在所有癌症中,胃癌的死亡率排第3位,仅在肺癌和肝癌之后[1]。由于早期胃癌的症状并不典型,部分患者仅表现为腹痛、腹胀,因而并未引起重视,待到确诊时病程已进入进展期。经过及时治疗,早期胃癌的5年生存率可达95%以上;但中晚期胃癌即便进行了外科手术,患者的中位生存时间仍旧不到1年[2]。因此,虽然近年来胃癌的诊疗技术有所提高,但胃癌仍是造成中国癌症负担的重要因素之一。

在胃癌诊断标志物的研究中,常规用于临床的生物标志物有HER-2、CEA和CA19-9等,但这些标志物在早期诊断方面仍缺乏足够的特异性和敏感性[3]。在胃癌的治疗中,虽然曲妥珠单抗、雷莫芦单抗和阿帕替尼等药物被批准用于晚期胃癌的治疗,但由于胃癌的发病机制复杂和高度异质性的特点,使其靶向治疗的作用有限[4]。因此,探索胃癌的发病机制、发现有助于胃癌早期诊断的生物标志物、提高胃癌的早期诊断率并寻找新的治疗靶点有非常重要的意义。

有研究表明糖酵解在肿瘤的发生发展中起着重要作用,由于肿瘤细胞的繁殖十分迅速,使其即使处在正常的氧气浓度下依然会消耗葡萄糖产生大量乳酸,这种现象被称作“Warburg效应”或“有氧糖酵解”[5]。M2型丙酮酸激酶[6](M2 isoform of pyruvate kinase,PKM2)和醛缩酶A[7](transcriptional levels of aldolase A,ALDOA)与糖酵解关系密切,并在肿瘤细胞中高度表达,可作为新的肿瘤标志物在肿瘤的早期诊断及预后判断中发挥一定作用。本研究采用免疫组化技术(immunohistochemistry,IHC)检测胃癌细胞中PKM2和ALDOA的表达情况,并与胃癌组织的病理特征进行对比分析,探索其在胃癌的发生、发展及预后中的作用,以期为临床上胃癌的诊断和治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究以2020年至2022年间于安徽理工大学第一附属医院普外三科行胃癌根治术的30例患者为研究对象。所有患者均术后均对手术标本进行病理活检,并进行TNM分期,确保获得完整的临床病理数据。纳入与排除标准如下,纳入标准:①病理活检确诊为胃癌;②围手术期内未出现死亡事件;③所有病例手术前均未接受过任何放射及化学治疗。排除标准:①临床资料不完整;②合并其他恶性肿瘤;③合并其他严重疾病。

1.2 免疫组织化学法检测

胃癌组织中PKM2和ALDOA的表达用免疫组织化学法检测:①将切片脱蜡至水化;②抗原修复;③用3%的过氧化氢水溶液阻断内源性过氧化物酶;④血清封闭30min;⑤甩掉封闭液,滴加1∶200比例稀释PKM2一抗(货号bs-0101R,购自bioss)或者ALDOA一抗(货号BS-2406R,购自bioss),置于湿盒内4℃孵育过夜;⑥加入1∶200比例稀释的二抗(HRP 标记的山羊抗兔IgG,货号GB23303,购自Servicebio);⑦用DAB显色液对其染色;⑧用苏木素复染细胞核;⑨经脱水封片后置于白光显微镜下进行结果分析。细胞核经苏木素染色后呈蓝色,PKM2和ALDOA经DAB显色后均为棕黄色。

1.3 评分标准

每张完成染色的标本切片交予两名高年资病理专家于200倍镜下对细胞染色强度及细胞阳性率进行判读。细胞染色强度判定:胞质无着色为0分、淡黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分;细胞阳性率判定:0～5%判为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、≥76%为4分。最终得分以细胞阳性率(0～4分)与染色程度(0～3分)的分值相乘,0分为(-)、1～4分为(-/+)、5～8分为(+)、9～12分为(++),其中以(++)为其在胃癌组织中高表达。

1.4 统计学方法

2 结果与分析

2.1 受试者基本特征

纳入研究的30名受试者其中,男性16例,女性14例;年龄≤60岁的患者6例,>60岁的24例,平均年龄为(68.77±8.25)岁;肿瘤浸润深度:T1～T2的有10例,T3～T4的有20例;有/无淋巴转移的有10/20例;早期(Ⅰ+Ⅱ期)患者13例,晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者17例;肿瘤最大直径:<5cm的有18例,≥5cm的有12例;低分化患者14例,中/高分化患者16例;血管侵犯有/无分别为20例、10例,神经侵犯有/无分别为12例、18例。

2.2 PKM2和ALDOA在胃癌中的表达

PKM2主要在细胞质中表达,DAB染色呈弥漫的棕褐色。免疫组化结果根据染色程度和细胞阳性率对PKM2的表达强度进行判定。如图1(a)所示PKM2的表达强度为“-”,图1(b)表示PKM2的表达强度为“-/+”,图1(c)表示PKM2的表达强度为“+”,图1(d)表示PKM2的表达强度为“++”。

图1 PKM2在胃癌组织中的表达(×200)

ALDOA同样在细胞质中表达,免疫组化DAB显色及结果判定与PKM2相同。如图2(a)所示ALDOA的表达强度为“-”,图2(b)表示ALDOA的表达强度为“-/+”,图2(c)表示ALDOA的表达强度为“+”,图2(d)表示ALDOA的表达强度为“++”。

图2 ALDOA在胃癌组织中的表达(×200)

如图3所示,在胃癌组织中,PKM2高表达17例,低表达13例,高表达率为57%;ALDOA高表达18例,低表达12例,高表达率为60%。

图3 PKM2和ALDOA的阳性表达数

2.3 PKM2的表达与胃癌病理特征的关系

如表1所示,浸润深度为T1～T2的胃癌组织中PKM2的高表达率为20%(2/10),低于T3～T4组的75%(15/20);TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的胃癌组织中PKM2高表达率为31%(4/13),低于Ⅲ～Ⅳ期的76%(13/17);低分化组中PKM2的高表达率为29%(4/14),低于中/高分化组的81%(13/16);PKM2的表达与胃癌组织的浸润深度、TNM分期及分化程度具有相关性,差异均具有统计学意义(P<0.05)。而其他因素如性别、年龄、肿瘤大小、有无淋巴转移、神经和血管侵犯,与PKM2的表达未见明显相关(P>0.05)。

表1 PKM2的表达与临床病理特征的关系

2.4 ALDOA的表达与胃癌病理特征的关系

如表2所示,浸润深度为T1～T2的胃癌组织中ALDOA的高表达率为30%(3/10),低于T3～T4组的75%(15/20);低分化组中ALDOA的高表达率为36%(5/14),低于中/高分化组的81%(13/16);ALDOA的表达与胃癌组织的浸润深度和分化程度具有相关性,差异均具有统计学意义(P<0.05)。其他因素如性别、年龄、有无淋巴转移、TNM分期、肿瘤大小和有无神经、血管侵犯,与ALDOA的表达未见明显相关(P>0.05)。

表2 ALDOA的表达与临床病理特征的关系

3 讨论

肿瘤细胞的增殖、浸润和转移等恶性生物学行为是造成患者死亡的主要原因,这种恶性生物学行为需要大量的能量支持,其中糖代谢是肿瘤细胞最主要的供能方式之一。由于肿瘤的快速增长,即便在正常氧气浓度下,肿瘤细胞也始终处在一种微缺氧状态,导致肿瘤细胞的供能方式从氧化磷酸化转为糖酵解。这种适应性反应被称为“Warburg效应”或“有氧糖酵解”。因此,作用于糖酵解途径中的酶可能会在癌症组织中受到调控[8]。丙酮酸激酶作用于糖酵解途径,可催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP反应并产生丙酮酸和ATP。其中PKM2常在一些需大量增殖的细胞和大多数的肿瘤细胞中被发现。PKM2有两种表现形式:一种是主要作用于有氧氧化的高活性四聚体,另一种是有利于有氧糖酵解的低活性二聚体[9-10]。这两种形式表现出来的动态平衡可使肿瘤细胞在营养不足的环境下调节自身合成和营养代谢,从而起到促进肿瘤发生发展的作用。除了与恶性肿瘤的发生相关外,PKM2的过表达还可以反应肿瘤的预后。与正常组织相比,PKM2在肿瘤组织中的mRNA和蛋白质水平都过表达,并且PKM2蛋白的表达和胃癌患者的生存率呈负相关,从而PKM2的表达可以被认为是胃印戒细胞癌患者预后的危险因素之一[11]。文献[12]的研究进一步表明了PKM2的高表达对维持GC细胞的恶性表型起着重要作用,抑制PKM2依赖性的糖酵解可能成为胃癌治疗的新方向。本研究应用IHC技术对胃癌患者的术后标本进行检测,结果发现,30例胃癌组织标本中,PKM2高表达的有17例,其高表达率为57%。进一步比较发现PKM2的表达与胃癌组织的浸润深度、TNM分期以及分化程度有关,即PKM2的表达率随着病情的推进而升高,与之前的研究结果相符。

ALDOA作为一种调节酶,不仅参与糖酵解,还参与调节糖异生[13]。糖酵解和糖异生都可为肿瘤细胞的增殖提供能量,越来越多的研究证明ALDOA在几种癌症的病理进展中也起着重要作用。文献[14]研究发现ALDOA在子宫颈宫颈腺癌中的高表达与淋巴结转移、淋巴血管浸润还有总生存期短相关,而ALDOA的表达被抑制后则明显降低了宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭性。文献[15]对肝内胆管癌的研究得出,ALDOA高表达与患者的预后呈负相关,同时发现ALDOA介导的糖酵解增强是促进肿瘤细胞增殖和转移的因素之一。上述结果在肺癌[16]、肝癌[17]和肾癌[18]的研究中均能得到验证。本研究显示,在30例胃癌组织标本中,ALDOA高表达的有18例,其高表达率为60%,并且与胃癌组织的浸润深度和分化程度具有相关性,即ALDOA的表达同样随着胃癌病情的进展而增加。本研究所得结果与ALDOA在其他多种癌症中的表达情况一致,提示ALDOA同样促进了胃癌的发生发展,可以为胃癌诊断和治疗提供新的思路。

本研究发现PKM2和ALDOA的表达是随着疾病的进展而增加,表明作为糖酵解调节酶的PKM2和ALDOA或许可通过增强供能在肿瘤的生长过程中发挥着重要作用,促进肿瘤的发生发展;而抑制PKM2和ALDOA的表达、阻断二者的作用途径,或许可以作为胃癌治疗的新靶点。TNM分期是影响肿瘤预后的关键因素,本研究发现PKM2和ALDOA的表达与TNM的分期具有相关性,这表明通过检测PKM2和ALDOA的表达强度有助于判断病人预后及危重程度,从而制定最佳的治疗方案。

4 结论

本研究显示,PKM2和ALDOA在胃癌组织中均存在高表达,并且与疾病的进展存在相关性。这表明胃癌组织中可能存在通过增强糖酵解来促进肿瘤发生发展的机制,因此阻断PKM2和ALDOA、抑制糖酵解或许会为胃癌的治疗指明新方向。之前的研究认为,癌症的TNM分期与疾病的预后紧密相关。本研究得出PKM2和ALDOA的高表达与肿瘤的浸润、TNM分期明显相关,因而推测这两种酶或许可以作为胃癌发生发展的重要标志物,并借此来估计胃癌的预后。

本研究样本量较小,所得的结果可能存在偏差,还需进一步扩大样本量以证实上述结果。考虑到手术病理切片的获取过程相对繁杂,后续的实验计划可从胃癌患者的血清着手,研究PKM2和ALDOA在血清和组织切片中是否是相同的表达模式,为开发新的血清学胃癌标志物奠定理论基础。