韭黄发酵前后挥发性风味成分及游离氨基酸变化分析

国光梅，李立郎，魏福晓，周 美，王 丽，李齐激，安正斌，杨小生，王 瑜*

（1.贵州省天然产物研究中心，贵州 贵阳 550014；2.贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550014）

韭黄（Allium senescens）又名黄韭、韭菜白，属百合科多年生草本植物[1]，为韭菜通过培土、遮光覆盖等措施，在不见光的环境下经软化栽培后的黄化韭菜[2]，具有特殊的强烈气味，是我国重要的葱类蔬菜之一。韭黄含丰富的蛋白质、维生素、矿物质、甙类和苦味物质，味道鲜美，能促进食欲[3-4]。韭黄性温，味辛，《本草纲目》记载，韭黄具有固肾缩尿之功效；此外，韭黄含有特殊的挥发性精油，有助于疏调肝气，增强消化功能；韭黄的辛辣气味有散瘀活血，行气导滞作用，用于治疗跌打损伤、吐血、胸痛等症状[5]。目前，韭黄初加工产生的废弃物量大，且这部分废弃物主要作为有机肥发酵原料进行处理，这是对优质资源的极大浪费。因此，亟需对韭黄副产物开展精深加工，提高其经济附加值，延伸产业链。

以新鲜蔬菜为原料的微生物发酵产品由于含有丰富的营养成分，具有抗氧化、调节肠道菌群等多种功能而备受关注[6]。在发酵过程中，微生物通过自身的生长和代谢作用，使底物产生一系列的生物化学变化，得到的发酵产物不仅保留了底物特有的风味和营养成分，还能使风味和口感得到明显改善[7]。维持人体健康的营养成分游离氨基酸，可被人体直接吸收利用，不仅可以增强机体新陈代谢、提高免疫力，同时参与氮代谢作用[8-9]，也可与口腔中的味蕾结合产生酸、甜、苦、鲜或咸等滋味[10]，挥发性风味成分则是评价发酵液风味的重要指标[11]。目前，有关韭黄中氨基酸的呈味特性和营养价值评价的报道较少，本研究以新鲜韭黄为原料，加入白砂糖、活性干酵母菌粉，经过恒温发酵制备具有抗疲劳、滋阴补肾的微生物发酵产品。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）技术分析韭黄发酵前后挥发性成分的变化，采用氨基酸自动分析仪分析韭黄发酵前后游离氨基酸种类及含量变化，并通过滋味强度值（taste activity value，TAV）筛选其特征呈味物质，以期为韭黄精深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜韭黄：安顺普定县韭黄种植基地；纤维素酶（20 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品级）：云南文山英茂糖业有限公司。

氨基酸混合标准溶液浓度为100 nmol/L（磷酸丝氨酸、牛磺酸、磷乙醇氨、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、α-氨基己二酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基异丁酸、γ-氨基丁酸、组氨酸、3-甲基组氨酸、1-甲基组氨酸、色氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、氨、精氨酸、尿素、肌肽、羟脯氨酸和脯氨酸）：德国SYKAM公司。

柠檬酸-柠檬酸锂缓冲液的pH分别为2.90、4.20、8.00。

1.2 仪器与设备

HP6890/5975C GC-MS联用仪、HP-5MS色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；57333-U固相微萃取装置：美国Supelco公司；SKG-PB-936型打浆机：上海达瑞宝食品机械有限公司；AG285型电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；S433D型全自动氨基酸分析仪：德国SYKAM公司；Millipore-0026型超纯水机：美国默克密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 韭黄发酵液的制备

酵母粉活化：采用10%的白糖水，按总质量0.01%添加安琪活性干酵母粉，在32 ℃的恒温水浴锅中搅拌均匀，活化15 min，待用。

菌酶混合发酵：根据前期预实验结果，将韭黄破碎液冷却温度降至40～45 ℃时，按其总质量的0.02%添加纤维素酶，45 ℃恒温条件下酶解2 h，加入活化好的酵母菌种液，控制发酵温度在25～30 ℃，有氧发酵15 d，至韭黄发酵液澄清度、发酵液的糖度≤5°Bx即完成发酵，得韭黄发酵液。

1.3.2 挥发性风味成分分析

挥发性风味成分分析采用HS-SPME-GC-MS法。

前处理条件：新鲜韭黄发酵前后的样品经0.45μm微孔滤膜过滤后，称取5g，精密加入内标溶液3 μL（环己酮质量浓度为5.350 9 mg/mL，壬酸甲酯质量浓度为1.836 5 mg/mL）置于固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMSStableFlex纤维头的手动进样器，在60℃、150r/min磁力加热条件下顶空萃取60 min后，移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250 ℃）中，热解吸3 min进样。

气相色谱条件：HP-5MS色谱柱（60m×0.25mm×0.25μm），升温程序为初始温度42 ℃，保持2 min，以3.5 ℃/min升温至208 ℃，以10 ℃/min升温至310 ℃，保持2 min，运行时间61.43min；汽化室温度230℃；载气为高纯氦气（He）（99.999%）；柱前压15.98 psi，载气流量1.0 mL/min，分流比10∶1，溶剂延迟时间3 min。

质谱条件：电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 635 V；接口温度280 ℃；质量范围29～500 amu。

定性定量方法：各峰经质谱计算机数据系统检索，并通过比对美国国家标准技术研究所（national Institute of standards and technology，NIST）20和Wiley 275标准质谱图，对挥发性风味成分定性。挥发性风味物质的定量测定采用内标半定量法[12]，各挥发性风味物质含量计算公式如下：

式中：C2-待测风味组分质量浓度，mg/kg；C1-内标质量浓度，mg/mL；S2-待测风味组分峰面积；S1-内标物峰面积；V内-内标物体积，mL；V样-样品取样量，mL。

1.3.3 游离氨基酸分析

游离氨基酸含量测定采用氨基酸分析仪。

称取新鲜韭黄样品100 g置于打浆机中打浆5 min后，称取10 g匀浆液，加体积分数为75%乙醇50 mL，超声提取20 min，过滤，减压回收乙醇，用10 mL乙醚萃取，水层蒸干，加0.02 mol/L HCl定容至10 mL，精密量取0.25 mL置于5 mL容量瓶中，定容、摇匀。韭黄发酵液样品：取1 mL样品，加9 mL 1%磺基水杨酸定容至10 mL，10 000 r/min离心10 min、用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液按照氨基酸分析仪器工作条件测定。

1.3.4 滋味强度值

滋味强度值（TAV）可以表示该物质对样品呈味特征的贡献度[8]，游离氨基酸的TAV计算公式如下：

式中：C为滋味物质的质量浓度，mg/g；T为滋味物质的呈味阈值，mg/g。

2 结果与分析

2.1 韭黄挥发性风味成分分析

韭黄发酵前、后样品的挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图见图1，各挥发性风味成分检测结果见表1。

表1 韭黄发酵前后样品中挥发性风味成分GC-MS分析结果Table 1 Results of volatile flavor components in Allium senescens samples before and after fermentation analyzed by GC-MS

图1 韭黄发酵前（a）、后（b）样品中挥发性风味成分GC-MS分析的总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of volatile flavor components in Allium senescens samples before (a) and after (b)fermentation analyzed by GC-MS

由表1可知，在韭黄发酵前样品中共检出74种挥发性风味成分，包括有机硫类40种、醛类16种、酯类7种、酸类1种、醇类3种和其他类7种，其中有机硫类含量最高；发酵后韭黄样品中共检出76种挥发性风味成分，包括有机硫类17种、醛类11种、酯类32种、酸类5种、醇类4种和其他类7种，其中酯类含量最高。

2.1.1 有机硫类物质

有机硫化合物是葱属植物的主要风味物质，赋予了葱属蔬菜极大的营养和药用价值。YABUKI Y等[13]研究表明，韭菜中主要以甲硫氨酸产生的二甲基二硫化物和二甲基三硫化物为主，其次是蒜氨酸产生的二烯丙基二硫和烯丙基1-（E）-丙烯基二硫化物。韭菜类似于大蒜的独特的辛辣香气是由于组织被碾碎或切碎时，通过蒜氨酸酶对半胱氨酸亚砜（cysteine sulfoxide，CSO）酶促降解，从而迅速产生具有独特气味的挥发性化合物[14]。通过检测结果可以看出，韭黄发酵前后有机硫化合物含量较高的主要是二甲基三硫、二甲基二硫、二烯丙基二硫醚、烯丙基甲基二硫醚、甲基烯丙基三硫醚。发酵后韭黄样品中有机硫类物质的种类和含量显著降低，发酵前韭黄样品中共检出有机硫类物质有40种，总含量高达197.754 mg/kg；发酵后韭黄样品中共检出有机硫类物质17种，总含量低至142.897 mg/kg。研究发现，微生物发酵能有效去除葱属植物的辛辣味及刺激性臭味，以改善口感，且在发酵过程伴随着有机硫化物的转变，这些硫化物的降解与生成可能来自于本身的酶促反应，或者美拉德的非酶反应，也可能来自于微生物对硫化物的利用[15]，韭黄发酵后有机硫类物质可能降解为酯类、醇类等香气物质。

2.1.2 醛类物质

醛类物质主要来源于原料中脂肪酸的氧化和蛋白质的Strecker降解反应，阈值较低，对风味的贡献较大[16]，韭黄的发酵过程是醛类物质向醇类物质和酸类物质的转变。发酵后韭黄中新增了正辛醛、葵醛、壬醛，均是油酸的氧化产物。其中正辛醛具有玫瑰和橙皮香味，壬醛具有玫瑰柑橘香味，是油酸的氧化产物。发酵前韭黄样品中共检出醛类物质有16种，总含量为31.986 mg/kg，其中巴豆醛含量高达20.547 mg/kg，发酵后韭黄样品中共检出醛类物质有11种，总含量为9.935 mg/kg，未测出巴豆醛。这些变化主要是因为发酵后通过乳酸菌、醋酸菌等能够产酸的细菌代谢形成，且醛类物质在发酵过程中被还原形成醇类物质，因此赋予发酵产品独特的香味。

2.1.3 酯类物质

酯类物质是醇与羧酸和氨基酸发生酯化反应的产物，大多数酯类具有令人愉悦的花果香[17]。发酵前韭黄样品中共检出酯类物质7种，总含量为0.078 mg/kg；发酵后韭黄样品中共检出酯类物质32种，总含量为80.843mg/kg，韭黄经发酵后含量较高的酯类化合物分别为辛酸乙酯（44.542 mg/kg）、乙酸乙酯（21.937 mg/kg）、正己酸乙酯（3.163 mg/kg）。其中辛酸乙酯具有果香、乙酸乙酯具有似菠萝、苹果和香蕉的水果香气，正己酸乙酯具有果香、甜香[18]，说明韭黄发酵后，酯类物质的种类和含量显著增加，风味也得到了一定程度的改善。

2.1.4 酸类物质

酸类物质的含量和种类取决于营养物质含量和酵母的使用[19]，微生物发酵的代谢途径主要有醋酸、乙醇、乳酸、柠檬酸发酵，前期糖代谢可以为微生物提供发酵原料。发酵前韭黄样品中共检出1种棕榈酸，含量为0.014 mg/kg；韭黄发酵后样品中共检出酸类5种，总含量高达72.363 mg/kg。其中醋酸含量为48.765 mg/kg，辛酸含量为23.406 mg/kg。在酵母菌的发酵下，好氧型的醋酸菌能将乙醇转化为醋酸，另外乳酸菌发酵也可能产生醋酸[20]，所以新增了大量的醋酸。适量的酸味可赋予食品舒适、柔和的口味，与酯类、醇类物质含量配比恰当，有助于样品的呈香。

2.1.5 醇类物质

韭黄的发酵过程是醛类物质向醇类物质和酸类物质的转变。醇类物质是由酵母菌分解糖或氨基酸脱氨的代谢产物产生，赋予产品花香和水果香[21]，对风味具有重要作用。相对于新鲜韭黄，韭黄发酵液中醇类物质中的乙醇、芳樟醇、异戊醇含量大幅提高，其中乙醇含量最高（650.290 mg/kg）。在酵母菌的发酵下，乙醛被还原为乙醇，实现了醛类物质向醇类物质的转变，韭黄发酵后样品中共检出醇类物质4种，总含量为673.390 mg/kg。其中芳樟醇具有花香味，异戊醇具有水果香、酒香味[22]，均对韭黄发酵液风味带来积极的作用。

2.2 韭黄发酵前后游离氨基酸含量分析结果

2.2.1 游离氨基酸检测结果分析

35种氨基酸混合标准溶液与韭黄发酵前后样品的游离氨基酸检测色谱图见图2。

图2 氨基酸混合标准液（a），发酵前（b）、后（c）韭黄样品中游离氨基酸检测色谱图Fig.2 Chromatograms of free amino acids in amino acid mixed standard solution (a), Allium senescens samples before (b)and after (c) fermentation

2.2.2 游离氨基酸呈味特征和滋味强度值分析

食物中所含氨基酸由两部分组成，一是作为蛋白质基本结构的非游离氨基酸，另一部分是处于游离状态的氨基酸。非游离氨基酸在食用过程中并不能立即水解，对食品的滋味贡献不大，因此研究氨基酸对食品滋味的贡献时，有必要测定游离氨基酸的组成与含量[23-25]。氨基酸在结构上的差别取决于侧链基团的不同，这一差别也影响了氨基酸的口味感官。按照氨基酸的味觉强度，可以大致把氨基酸分为甜味氨基酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Pro、His）、苦味氨基酸（Val、Leu、Ile、Met、Trp、Arg）、鲜味氨基酸（Lys、Glu、Asp）、芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Cys）[26]。

根据各游离氨基酸阈值计算TAV，其值越大对样品的呈味贡献越大，反之亦然。当TAV＞1时，说明该呈味氨基酸对呈味有贡献，而TAV＜1时，该呈味氨基酸对呈味贡献不大，呈味作用不显著[27-30]。韭黄发酵前后游离氨基酸含量、阈值、呈味特性及TAV见表2。

表2 韭黄发酵前后样品中游离氨基酸含量、味道阈值、呈味特性及滋味强度值Table 2 Contents, taste thresholds, taste attributes and taste intensity value of free amino acids in Allium senescens before and after fermentation

由表2可知，韭黄发酵前样品中共检出游离氨基酸22种，其中包括8种必需氨基酸，必需氨基酸总含量为24.861 mg/g，甜味、苦味、鲜味、芳香族氨基酸含量分别为49.877 mg/g、13.398 mg/g、19.142 mg/g、7.154 mg/g。韭黄发酵后样品中共检出游离氨基酸21种，其中包括7种必需氨基酸，必需氨基酸总含量为5.013 mg/g，甜味、苦味、鲜味、芳香族氨基酸含量分别为19.269 mg/g、2.411 mg/g、9.763 mg/g、1.925 mg/g。

韭黄发酵前样品中有17种呈味氨基酸的TAV＞1，韭黄发酵后样品中有10种氨基酸的TAV＞1，7种氨基酸的TAV＜1。韭黄发酵前样品中氨基酸滋味影响大小依次为半胱氨酸（Cys）＞丙氨酸（Ala）＞谷氨酸（Glu）＞缬氨酸（Val）＞组氨酸（His）＞赖氨酸（Lys）＞丝氨酸（Ser）＞天冬氨酸（Asp）＞精氨酸（Arg）＞苯丙氨酸（Phe）＞异亮氨酸（Ile）＞苏氨酸（Thr）＞亮氨酸（Leu）＞蛋氨酸（Met）＞甘氨酸（Gly）＞脯氨酸（Pro）＞酪氨酸（Tyr）。韭黄发酵后样品中氨基酸滋味影响大小依次为半胱氨酸（Cys）＞谷氨酸（Glu）＞丙氨酸（Ala）＞赖氨酸（Lys）＞甘氨酸（Gly）＞组氨酸（His）＞天冬氨酸（Asp）＞精氨酸（Arg）＞脯氨酸（Pro）＞丝氨酸（Ser）＞蛋氨酸（Met）＞缬氨酸（Val）＞苯丙氨酸（Phe）＞亮氨酸（Leu）＞苏氨酸（Thr）＞酪氨酸（Tyr）＞异亮氨酸（Ile）。

在韭黄发酵前后样品中，丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸含量较高，发酵前分别为23.808 mg/g、7.512 mg/g、4.449mg/g、2.437mg/g。发酵后分别为9.880mg/g、6.403mg/g、3.905 mg/g、2.801 mg/g。谷氨酸是食品中鲜味的呈味剂，丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸是甜味的呈味剂，它们对韭黄的滋味起着关键作用。韭黄中苦味氨基酸含量发酵后显著降低，且发酵液中的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸4种苦味氨基酸含量均低于呈味阈值，可有效增强其他氨基酸的鲜味和甜味，由此可见，发酵后苦味氨基酸含量降低改善了韭黄发酵液的滋味。

除了影响滋味以外，氨基酸在维持人体健康方面具有非常重要的作用，如在新鲜韭黄和韭黄发酵液中含量较高的丙氨酸可增强记忆力以及学习的能力；谷氨酸通过调节突触可塑性和神经回路功能从而发挥兴奋中枢神经系统功能，此外，谷氨酸还参与消化系统、免疫系统的许多功能，被称为“功能性氨基酸”；脯氨酸对维持皮肤和结缔组织的健康生长非常重要；甘氨酸广泛存在于人体结缔组织中，对人体消化系统、神经系统有积极作用。这与韭黄具有抗疲劳、增强免疫、促进消化的传统功效一致。

3 结论

本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（HS-SPME-GC-MS）和氨基酸分析仪对韭黄发酵前后样品的挥发性风味成分和游离氨基酸进行测定，并通过滋味强度值（TAV）筛选特征呈味物质。结果表明，韭黄发酵前、后样品中分别共检出74种、76种挥发性风味成分。韭黄发酵液中有机硫类化合物相对含量显著降低，醇类化合物相对含量增加，产生了让人愉悦的酯类化合物，这是韭黄发酵液特殊风味减弱的主要原因。发酵前韭黄检出游离氨基酸22种，必需氨基酸总含量为24.861 mg/g，甜味、苦味、鲜味、芳香族氨基酸含量分别为49.877 mg/g、13.398 mg/g、19.142 mg/g、7.154 mg/g。发酵后韭黄检出游离氨基酸21种，其中包括7种必需氨基酸，必需氨基酸总含量为5.013 mg/g，甜味、苦味、鲜味、芳香族氨基酸含量分别为19.269 mg/g、2.411 mg/g、9.763 mg/g、1.925 mg/g。韭黄发酵液中苦味氨基酸的含量显著降低，改善了发酵液的滋味。通过系统的分析韭黄发酵前后风味、滋味的变化，可为韭黄精深加工提供基础支持。