碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌耐药机制与治疗现状

俞 蕙

复旦大学附属儿科医院感染传染科（上海 201102）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA)又称绿脓杆菌，属于假单胞菌属，革兰阴性杆菌，是导致免疫力低下的住院患者和囊性纤维化患者感染的主要原因。近年来随着碳青霉烯类抗生素广泛用于控制PA 严重感染，以及PA 复杂的耐药机制，碳青霉烯类耐药铜绿假单孢菌(carbapenem resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA) 已开始大规模出现，世界卫生组织(WHO)在2017年将CRPA列为急需开发新型抗生素治疗其感染的三种细菌之一[1]，以突出其在临床上的严峻形势。儿童免疫力低下，细菌感染导致的危害更为严重，因此充分了解CRPA的耐药机制及治疗现状，加强对CRPA 的管理尤为重要。

1 CRPA在儿童群体中的流行现状

根据中国儿童细菌耐药监测组（The Infectious Disease Surveillance of Pediatrics，ISPED）对儿童细菌耐药的监测数据[2]，虽然PA 对美罗培南的耐药率呈下降趋势（从2016 年的15.8%下降至2020 年的6.1%），但在美国儿童群体中，CRPA 的比例从1999年的9.4%增加到2012年的20%[3]，在欧洲儿科患者中，从2004—2012年到2013—2018年，PA对碳青霉烯类抗生素的耐药率显著增加（从9.1%到12.4%）[4]。

2 PA对碳青霉烯类药物的耐药机制

PA 对抗生素产生耐药的主要机制可分为内在性、获得性和适应性。内在性耐药机制指细菌通过自身固有的结构和功能对抗生素产生耐药[5]，包括外膜通透性降低、外排泵过度表达、产生抗生素灭活酶。获得性耐药机制指细菌通过遗传元件的水平转移和基因变异获得抗生素耐药性。适应性耐药机制是指细菌在抗生素或其他环境因素的刺激下某些基因和/或蛋白的暂时改变，且这种改变是可逆的，主要指生物膜的形成。

2.1 内在性耐药机制

2.1.1 外膜通透性降低 革兰阴性杆菌的外膜是由磷脂和脂多糖构成的不对称双分子层，虽可选择性防止抗生素穿透，但抗生素仍可通过内嵌的孔道蛋白进入细菌。孔道蛋白主要包括4 类：非特异性孔蛋白，允许小的亲水性分子缓慢扩散；特定孔蛋白，具有结合特定分子的特定位点；门控孔蛋白，是离子调节的外膜蛋白，负责摄取离子复合物；外排孔蛋白，外排泵的重要组成部分。在PA中，OprF蛋白是主要的非特异性孔蛋白；特定孔蛋白主要包括OprB、OprD、OprE、OprO和OprP；OprC和OprH属于门控孔蛋白类；外排孔蛋白包括OprM、OprN 和OprJ[6]。导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药的主要包括OprD 和外排孔蛋白，OprD 含有碳青霉烯类抗生素的结合位点，其缺乏会导致其对碳青霉烯类抗生素，特别是亚胺培南产生耐药性[7]。关于外排孔蛋白将在外排泵过度表达部分展开。

2.1.2 外排泵过表达 细菌可以通过外排泵系统将进入胞内的抗菌药物泵出胞外，从而使菌体内药物浓度降低而导致耐药。外排泵系统主要包括RND 家族、MFS 超家族、ABC 超家族、SMR 家族、MATE 家族。与PA 耐药性相关的主要是RND 家族，其由内膜蛋白、连接蛋白、外膜蛋白（即外排孔蛋白）组成[8]。PA共表达12个RND系列外排泵，其中4个（MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN和MexXY-OprM）与其耐药性密切相关[9]。MexABOprM过表达导致PA对美罗培南耐药，报道往往显示MexAB-OprM过表达和OprD缺乏相结合使PA对碳青霉烯类抗生素均产生高度耐药性。Hassuna等[10]检测到634株CRPA中MexCD-OprJ、MexXY-OprM的表达率分别为75%、62%，显示PA对美罗培南和亚胺培南的耐药率与MexXY-OprM和MexCD-OprJ外排泵表达呈高度正相关。

2.1.3 抗生素灭活酶的产生 许多抗生素具有易于水解的化学键，而细菌产生的可以水解或修饰这些抗生素内在结构使之失活的灭活酶正是细菌内在耐药性的重要组成部分。CRPA 产生的抗生素灭活酶主要是碳青霉烯酶，分布在A、B、D类β-内酰胺酶中。B类金属酶主要包括IMP、VIM、NDM、SPM、GIM、FIM、SIM、DIM 等类型。其中，IMP、VIM 和NDM-1 是导致对所有碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，而有关VIM-2的报道最频繁。在A类β-内酰胺酶中，最常见的是KPC型碳青霉烯酶及GES型碳青霉烯酶。而D类β-内酰胺酶中，文献报道的包括OXA-40、OXA-48、OXA-181和OXA-198[11]。在一项全球前瞻性队列研究中，972株CRPA分离株中211 株(22%)检出碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-2最为常见，在83 株菌(39%的产碳青霉烯酶CRPA 分离株)中作为唯一的碳青霉烯酶基因，在20株菌(9%的产碳青霉烯酶CRPA分离株)中与blaVIM-2同时存在。52株菌(25%产碳青霉烯酶的CRPA菌株)唯一碳青霉烯酶基因为blaVIM-2。其他常见的碳青霉烯酶基因有blaNDM-1、blaIMP-1和blaGES-5。只有1 株菌含有D 类碳青霉烯酶基因(blaOXA-23)[12]。此外尚有新型碳青霉烯酶不断出现，如Schauer 等[13]报道的新型A 类碳青霉烯酶GPC-1，这也为临床诊断识别和治疗不断带来新的挑战。

除了碳青霉烯酶，Ampc 酶在PA 对碳青霉烯类抗生素产生耐药中同样发挥重大作用，Yin 等[14]对141株碳青霉烯类抗生素耐药的PA进行基因分析时，96株(68.09%)AmpC过表达，12株(8.51%)菌株表现为临界性增加，表明在Ampc 酶的高产量同样会导致此类耐药产生。

2.2 获得性耐药机制

2.2.1 水平基因转移 抗生素耐药基因可以携带在质粒、转座子、整合子和前噬菌体上，细菌可以通过水平基因转移从相同或不同的细菌物种获得这些基因[15]。上文所述的主要碳青霉烯酶的基因都是由遗传元件携带的，包括整合子和质粒。在目前发现的6 种耐药相关整合子中，Ⅰ类整合子因携带耐药基因繁多而被广泛关注。PA 中，除了blaSPM-1、blaNDM-1和blaKPC-2，大多数获得性碳青霉烯酶存在于Tn402类转座子的I类整合子上，且大多数携带碳青霉烯酶基因的整合子都含有介导对其他抗生素耐药的基因盒，导致CRPA 菌株的产生[16]。目前已报道多种在PA发现的携带碳青霉烯酶基因的相关质粒，如携带blaVIM-2的质粒pJB12[17]和质粒pS04 90[18]、携带blaIMP-9的质粒pOZ 176[19]等。碳青霉烯酶与整合子和质粒之间的密切关联，使耐药性得以快速传播。

2.2.2 基因变异 PA能够通过染色体突变对所有类别的抗生素产生耐药性，突变可以导致抗生素靶标的修饰、外膜通透性降低、外排泵过表达以及抗生素灭活酶的过度产生，从而导致细菌耐药性获得或增加。在慢性囊性纤维化患者中，患者通常感染抗生素敏感的PA分离株，该分离株在长期感染和治疗过程中会产生耐药性，导致病情恶化[20]。

2.3 适应性耐药机制——生物膜形成

生物膜介导的耐药机制包括形成胞外屏障导致抗生素穿透性差、胞外微环境改变导致生物膜中的细胞营养限制和生长缓慢、诱导适应性应激反应和持留菌（persistent cell）的形成[21]。持留菌形成是一种抗生素存在下的表型变异，没有耐药基因，但却对高浓度抗生素有耐受性。其处于关闭抗生素靶标合成通路的休眠状态，可以躲避抗生素的杀伤作用，并在移除抗生素后重新繁殖形成生物膜，是PA慢性感染迁延不愈的主要原因[22]。PA 生物膜的形成受多因素调控，包括群体感应系统、Gacs/GacA和RetS/LadS 双组分调控系统（TCS）、胞外多糖和cdi-GMP[23]。群体感应是细菌之间的信号传递机制，细菌通过分泌信号分子感应周围环境中同类细菌的群体密度变动，当信号分子的浓度达到一定阈值就会启动菌体内相关基因的表达，改变生理特性，控制生物膜形成的速率和范围。PA拥有3个主要的群体感应系统：LasI-LasR、RhlI-RhlR和PQS-MvfR，所有这些系统都有助于生物膜的形成[22]。GacA是一种具有转录调控功能的反应调节因子，它控制编码2个小的非编码RNA——RsmY和RsmZ靶基因的表达，其高表达显著促进生物膜的形成[24]。在gacs突变体中，缺乏这些sRNA 的表达会导致生物膜形成受损[25]。PA中，这两个sRNA的表达受一个复杂调控网络的控制，该网络不仅涉及Gacs/GacA TCS，而且还涉及其他TCS途径：RetS通过干扰Gacs/GacA TCS活性来抑制rsmY和rsmZ基因的表达；PA1611通过抵消RetS对GACS的干扰效应，诱导这两个基因的表达；LsdS已被证明能激活rsmZ基因的表达[24]。另外3种不同的胞外多糖（Psl、Pel 和藻酸盐）在生物膜的形成和维持中也发挥着重要作用。环状di-GMP（c-di-GMP）是细胞信号转导中的第二信使，可以协调从活动性到静止的“生活方式转变”。目前已普遍认为在PA细胞中高浓度c-di-GMP与生物膜形成之间的相关性[26]。对这些调控生物膜形成因素的深入认识有助于对CRPA 耐药机制的进一步认识，并为研制新型药物开发新思路。

3 CRPA的治疗现状

目前针对CRPA感染的治疗药物选择较为有限，大多推荐采用新型β内酰胺类抗生素或联合用药方案治疗。2022年美国感染病学会对难治性耐药PA感染的治疗指导[27]指出：治疗对碳青霉烯类药物不敏感但对传统β内酰胺类药物敏感的PA引起的感染，建议选择传统β 内酰胺类药物大剂量延长输注时间，治疗对碳青霉烯类耐药但对传统β内酰胺类药物敏感的PA 引起的中重度感染或感染源控制不佳的患者，可使用新型β内酰胺类药物（如头孢洛扎-他唑巴坦、头孢他啶-阿维巴坦、亚胺培南-西司他丁-雷利巴坦，若药敏结果显示敏感）。另外，如果对首选的新型β内酰胺类抗菌药物体外药敏显示敏感，不推荐常规的联合抗菌药物治疗CRPA 引起的感染，会增加抗菌药物相关不良事件的可能性。但如果CRPA 对所有首选药物均不敏感，可考虑一种敏感的氨基糖苷类联合头孢洛扎-他唑巴坦、头孢他啶-阿维巴坦或亚胺培南-西司他丁-雷利巴坦，优先选择最小抑菌浓度最接近其敏感性临界点的β内酰胺类-β 内酰胺酶抑制剂复方制剂。如果体外药敏显示对氨基糖苷类也均不敏感，可考虑多黏菌素B联合β内酰胺类-β内酰胺酶抑制剂复方制剂。《中国铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识》[28]同样指出，对于CRPA所致的肺部感染，若药敏试验显示其对头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦、亚胺培南-西司他丁/雷利巴坦、美罗培南/法硼巴坦等新型酶抑制剂复合制剂敏感，仍然选择其作为一线选择；二线治疗可选择头孢地尔。在上述药物不可及或者不能耐受的情况下，可考虑使用以多黏菌素类药物为基础的联合治疗（如具有抗PA活性的β内酰胺类、环丙沙星、磷霉素等）。不同的是，欧洲临床微生物学和传染病学会（ESCMID）治疗耐多药革兰阴性杆菌感染的指南[29]提出，对于非重度感染或低风险CRPA 感染的患者，推荐使用传统的具有体外抗菌活性的单药治疗，当发生严重感染时，可选用多黏菌素、氨基糖苷类或磷霉素中的两种体外活性药物联合治疗。

氨曲南是目前唯一对B 类金属酶水解稳定的β-内酰胺类药物，由于作用于细菌细胞壁的不同靶位，将其与β-内酰胺酶抑制剂进行组合，于产碳青霉烯酶的耐药革兰阴性菌而言，是可予以期待的治疗方案。已有研究报道成功使用氨曲南联合头孢他啶-阿维巴坦治愈仅对阿米卡星和黏菌素敏感的产NDM-1和AmpC高表达的PA感染肺炎患者的临床案例[30]。目前我国指南中双β 内酰胺类抗生素联用的推荐方案中多包含氨曲南，如哌拉西林-他唑巴坦+氨曲南、头孢他啶+氨曲南、头孢吡肟+氨曲南[31]。

另外，2017年《广泛耐药革兰阴性菌感染的实验诊断、抗菌治疗及医院感染控制：中国专家共识》[31]也指出，感染控制不佳时可选用三药联合方案，如多黏菌素+β 内酰胺类+环丙沙星、多黏菌素+β 内酰胺类+磷霉素、多黏菌素静脉滴注+碳青霉烯类+多黏菌素雾化吸入、氨曲南+头孢他啶+阿米卡星。

在细菌耐药已经成为临床医学、公共卫生安全所关注的重点问题的背景下，PA对碳青霉烯类抗生素的耐药问题日益突出，不仅耐药机制繁多，而且大部分CRPA 的产生是由多种机制共同介导的，同时耐药基因的转移和变异也大大增加了耐药性的快速传播，为临床识别和治疗带来巨大挑战。新型β 内酰胺类抗生素的出现很大程度上解决了这一难题，但目前已有关于耐头孢他啶-阿维巴坦等新型抗生素的PA出现的相关报道，因此新药研发的脚步仍然不能停歇。