固表止嚏汤调控Th17细胞/Treg抗变应性鼻炎作用机制

杨世珍 郭兆刚 蔡亚梅 龚艳

摘要：固表止嚏汤是云南省名中医郭兆刚教授治疗过敏性鼻炎的有效验方，由生黄芪、白术、防风、荆芥、麻绒、紫苏叶、苍耳子、五味子、乌梅、黄芩、甘草为基本方组成。导师郭教授认为鼻鼽在临床上肺气虚寒者较多，强调调节阴阳，重在益气固表，祛风通窍，自拟固表止嚏汤。通过构建变应性鼻炎模型，研究固表止嚏汤通过调控Th17细胞/Treg平衡介导抗变应性鼻炎的作用机制。

关键词：固表止嚔汤、变应性鼻炎，Th17细胞，Treg

中图分类号：R765.21 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2023）09-0001-03

Discussion on the Action Mechanism of Exterior-strengthening and Sneeze-stoppingDecoction by Regulating Th17 Cells/Treg Against Allergic Rhinitis

YANG Shi-Zhen1， GUO Zhao-gang2， CAI Ya-Mei1， GONG Yan1

（1. Traditional Chinese Medicine Hospital of Yuxi City， Yuxi 653100， China;2. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China）

【Abstract】Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction is an effective prescription for the treatment of allergic rhinitis by Professor Guo Zhaogang， a famous Chinese medicine doctor in Yunnan Province， which is composed of raw astragalus， atractylodis， saposhnikovia， schizopeta， ephedra， perilla leaves， cocklebur， schisandra， mume， scubaicalensis and licorice. Professor Guo considers that allergic rhinitis is more qi deficiency and cold in lung clinically， emphasizing the regulation of yin and yang， stressing on tonifying qi and strengthening exterior， dispelling wind to clear apertures， thus making self-prescribed Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction. By constructing the model of allergic rhinitis， the study aims at the mechanism of antiallergic rhinitis mediated by the regulation of Th17 cell /Treg balance.

【Key words】Exterior-strengthening and Sneeze-stopping Decoction; Allergic Rhinitis; Th17 Cells; Treg

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科临床的一个常见病、多发病，是特应性个体接触了致敏原后由IgE介导的介质释放、并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜慢性炎症反应性疾病［1］。变应性鼻炎因其不断增高的发病率越来越得到医学界的重视，已被列入国家重点基础研究发展计划（973计划）［2］。研究已表明，在变应性鼻炎患者的外周血中，Treg细胞的数量减少，而Th17细胞的数量增加，Treg/Th17细胞失衡与AR发生密切相关。因此如何维持Treg/Th17细胞亚群间的平衡和自身内环境稳定，已成为治疗AR重要的药物靶点［3］。中医认为AR应归于“鼻鼽”，治疗上，遵循中医整体观念和辨证论治理论，调整脏腑阴阳平衡，改善患者的过敏体质，调节机体免疫功能，控制变态反应的发生，目前中药治疗已取得了显著疗效。临床上肺虚感寒、肺脾气虚、肾阳亏虚等为常见的临床证型［4］。固表止嚏汤选由具有抗变态反应作用的药物组方，方中所选药物，现代药理研究认为，都具有抗变态反应的作用，它们在变态反应的不同环节中发挥不同程度的作用［5］。

1 研究内容

采用卵清蛋白（OVA）+氢氧化铝粉基础致敏+强化致敏构建变应性鼻炎模型，固表止嚏汤药物干预后，通过变应性鼻炎症状评分表评价固表止嚏汤抗变应性鼻炎效应，HE染色评价固表止嚏汤对变应性鼻炎组织病理损伤的影响。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中IL-10、TGF-β和IL-17水平；实时定量PCR检测与分析鼻粘膜和脾淋巴细胞Th17相关基因（IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-23、RORγt和CCR6）和Treg细胞相关基因表达水平；流式细胞术（FACs）检测Th17和Treg细胞的表达水平。

2 材料与方法

2.1 实验动物 来源，种系，品系：BALB/c小鼠，7～8周龄，体重20～22g，雌性，斯贝福（北京）生物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2019-0010；动物饲养在SPF级动物房，实验动物至少饲养一周后使用。温度（22±1）℃，湿度（55±5）%，12 h光暗循环。饲料和水均在消毒后由動物自由摄取。所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。

2.2 固表止嚏汤浸膏的制备 固表止嚏汤，由生黄芪、白术、防风、荆芥、麻绒、紫苏叶、苍耳子、五味子、乌梅、黄芩、甘草为基本方组成，所需药材加水浸泡1h，煮沸2次，每次30min，过滤后并浓缩，折合原药材1 g浸膏相当于原药材2.6 g生药。

2.3 实验材料 主要试剂如表1。

2.4 主要仪器设 主要实验仪器如表2。

3 实验方法及评价

3.1 变应性鼻炎模型的诱导、分组和给药 60只BALB/C小鼠，随机分为6组：正常组、模型组、阳性药组（氯雷他定组）组、固表止嚏汤低、中、高剂量组，每组10只。采用卵清蛋白（OVA）+氢氧化铝粉滴鼻构建变应性鼻炎模型，具体为：鼻腔滴药后将100 μg卵清蛋白（OVA）和2mg氢氧化铝粉AL（OH）3溶入0.1mL生理盐水中，分别于第0、2、4、6、8、10、12、14天给予实验组（AR组）小鼠腹腔注射，自第15-25天每日将50 mg OVA溶入10 mL生理盐水中，滴鼻，每侧鼻孔10 mL，连续滴鼻11d。对照组使用生理盐水替代OVA同期进行腹腔注射以及滴鼻。第15天开始，固表止嚏汤低、中、高剂量组（7.5、15、30 g/kg），阳性药组以氯雷他定组（0.5 mg/kg）每天灌胃给药1次，共7 d，正常组和模型组灌胃等体积的生理盐水，给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。

3.2 指标检测

3.2.1 变应性鼻炎症状评分表 观察鼻部症状如鼻痒、流清涕、打喷嚏等出现的情况及轻重，并按照表3记录行为学得分。

3.2.2 鼻腔组织病理检测 末次OVA激发给药后，小鼠脱脊椎处死，鼻腔组织于4％多聚甲醛溶液中固定2h，石蜡包埋，切片，HE染色观察鼻腔组织病理变化。

3.2.3 Th17和Treg细胞相关细胞因子的检测 迅速摘眼球取血，3000 r/min离心10 min，分取上层血清，血清标本置于-20℃保存并立即送检。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中TGF-β和IL-17水平，实验方法详见说明书。

3.2.4 荧光定量PCR检测Th17和Treg相关基因得表达 取脾淋巴细胞1×107，应用Trizol试剂盒抽提细胞总RNA，采用超微量核酸蛋白检测仪测定其浓度。按照逆转录试剂盒说明，采用RT-PCR法制备cDNA。逆转录所得的cDNA用作PCR反应的模板。取同一个cDNA为模板，按照试剂盒说明书，实时定量PCR进行Th17相关基因和Treg细胞相关基因mRNA表达检测与分析，相关引物由Invitrogen公司合成。荧光定量PCR的结果以Ct值显示。实时荧光定量PCR中每个样本重复3次，取平均值为Ct值。

3.2.5 流式细胞术检测Th1和Treg细胞的表达水平 对胞内细胞因子染色：各组1×106个小鼠脾淋巴细胞和淋巴结细胞与PMA、Ionomycin以及BFA于5%CO2培养箱中共培养4h后，收集细胞，冼液冼2次，加入IgG抗体，封闭FcR，行标志CD4染色。完毕后，固定、穿膜，加入荧光标记的抗IL-17抗体和IFN-g，流式细胞仪检测分析。对于Treg细胞的检测，无需上述刺激，按胞内细胞因子染色检测，Flowjo软件分析

3.3 统计学方法 所有实验数据均采用统计学方法处理。均值间差异比较采用t检验或单因素方差分析，数据统计均以平均值±标准差表示，以P<0.05为显著水平。数据统计分析采用SPSS17.0统计软件包。

4 实验结果

4.1 固表止嚏汤对变应性鼻炎模型体重的影响 表4结果显示，与空白组比较，模型组小鼠体重下降，但差异无显著性意义（P>0.05）；与模型组比较，阳性组和固表止嚏汤低、中、高剂量组小鼠体重无明显差别（P>0.05）。见表4。

4.2 固表止嚏汤对变应性鼻炎症状评分的影响 表5结果显示，与空白组比较，模型组小鼠症状评分显著增加，差异具有显著性意义（P<0.01）；与模型组比较，阳性组和固表止嚏汤低、中、高剂量组症状评分显著减少，差异具有显著性意义（P<0.05）。见表5。

4.3 固表止嚏汤对变应性鼻炎模型鼻黏膜组织病理的影响 与空白组比较，模型组小鼠鼻黏膜有大量炎症细胞的浸润，固有层腺体增生明显，纤毛柱状上皮细胞排列缺乏完整性。与模型组比较，阳性药组和固表止嚏汤中、高剂量组鼻黏膜炎症细胞的浸润显著减少，固有层腺体增生改善，纤毛柱状上皮细胞排列较好，以阳性药和固表止嚏汤中剂量效果最好。见图1。

4.4 固表止嚏汤对变应性鼻炎模型血清细胞因子IL-17的影响 ELISA检测结果显示，与空白组比较，模型组小鼠血清IL-17水平升高，但差异无显著性意义。与模型组比较，阳性药组和固表止嚏汤低、中、高剂量组均低于模型组，其中中剂量差异具有显著性意义（P<0.05）。见表6。

4.5 固表止嚏汤对变应性鼻炎模型小鼠血清细胞因子TGF-b的影响 ELISA检测结果显示，与空白组比较，模型组小鼠血清TGF-b水平无明显变化，与模型组比较，固表止嚏汤高剂量组血清细胞因子TGF-b高于模型组，差异具有显著性意义（P<0.05）。见表7。

4.6 固表止嚏汤对变应性鼻炎模型Th17/Th1细胞表达的影响 流式细胞术检测变应性鼻炎模型小鼠脾脏和淋巴结Th17（CD4+IL-17+T细胞）和Th1细胞（CD4+IFN-g+T细胞）表达水平。结果显示，与模型组比较，固表止嚏汤给药组小鼠脾脏的CD4+IL-17+T细胞比例显著下降，差异具有显著性意义（P<0.05）。然而淋巴结2组Th17细胞表达无差异。2组小鼠淋巴结和脾脏Th1细胞表达水平均无显著差异。结果见图2。

4.7 固表止嚏汤对变应性鼻炎模型小鼠Treg细胞表达的影响 流式细胞术检测变应性鼻炎模型小鼠脾脏和淋巴结Treg细胞（CD4+Foxp3+T细胞）表达，结果显示，与模型组比较，固表止嚏汤药物干预显著上调变应性鼻炎模型小鼠脾脏和淋巴结Treg细胞比例，差异均具有显著性意义（P<0.05）。结果见图3。

5 小结

本研究结果证实，固表止嚏汤能够显著改善变应性鼻炎模型的炎症评分和鼻黏膜的病理损伤，减少黏膜组织炎症细胞的浸润，其作用机制与抑制Th17细胞，上调Treg细胞的表达，调控Th17细胞/Treg平衡有关。

参考文献：

［1］Baxi S N，Portnoy J M，Larenas-Linnemann D，et al.Exposure and health effects of fungi on Humans［J］.J Allergy Cli Immunol Pract，2016，4（3）：396-404.

［2］刘婷，朱玲.中医治疗变应性鼻炎研究进展［J］.中医药临床杂志志，2017，29（3）：436-438.

［3］hang C，Hong sJ Hu G.The expression of Treg/Thl7 cells related transcription factors and cytokines in PBMCs and plasma in patents with allergic rhinits［J］.LinChungErBiYanHouTunJingWaiKeZa Zhi，2012，26（s）：209-211.

［4］王俊壹，张卫华，刘舟.近五年中药治疗变应性鼻炎的实验研究进展［J］.现代中医药，2013，33（5）：134-136.

［5］沈映君.中藥药理学［M］.北京：人民卫生出版社，2011.