新方法制备的黑萝卜主要活性成分与抗氧化活性分析

梁英琪,林雯,林毅雄,张国广,邹金美

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建 漳州 363000；2.闽南师范大学菌物产业工程技术中心,福建 漳州 363000）

“老菜脯”是福建闽南和广东潮汕等地的一种传统的白萝卜腌制产品,由于存放时间较长,外观色泽呈黑色,故又称为“老萝卜”或“黑萝卜”[1].传统的制作方法是取秋季的新鲜白萝卜,加入粗盐,经过多次反复揉、搓、晒、压等工序,把萝卜中的水分去掉,然后放入陶瓷坛内压实,经过多年腌制自然陈放制得[2-4].一般陈放15 a 以上的老萝卜色泽变为乌黑色,味道别致,民间认为其具有清凉降火、健脾化滞、润肠通便的功效,甚至认为其具有治疗高血糖的功效,素有“赛人参”和“胃肠药”之称,常和排骨等食材一起炖汤食用[5].因传统加工方法耗时耗力,目前民间加工老菜脯的量逐年下降,且传统加工的黑萝卜含盐量较高,不符合现代低盐摄入的理念.由于其成品需要陈放十几年才能达到上市要求,占用库房的成本高,因此市场上基本没有工厂化生产的传统黑萝卜[6].本研究采用一种新方法制备出一种外观呈现黑色的萝卜,分析新方法制备的黑萝卜和原料白萝卜间的主要活性成分和抗氧化能力的变化, 为采用新方法工厂化制备营养与保健价值兼具的黑萝卜提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

暑季新鲜白萝卜购于市场；没食子酸（化学纯）购于Sigma 公司；芦丁（HPLC 级）购于中国食品药品检定研究院；DPPH（1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼）、TPTZ（2,4,6- 三（2- 吡啶基）-1,3,5- 三嗪）和ABTS（2,2- 联氮- 二（3- 乙基- 苯并噻唑-6- 磺酸）二铵盐）购自梯希爱上海化成公司；葡萄糖、乙酸、六水氯化铁、浓硫酸、盐酸、三水合乙酸、苯酚、无水乙醇、维生素C、三氯乙酸、磷酸氢二钾、过硫酸钾、水杨酸、七水合硫酸亚铁、抗坏血酸等试剂分析纯,购于中国国药集团化学试剂有限公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒,北京索莱宝科技有限公司；T9 双光束紫外可见光分光光度计,北京普析通用；电热恒温鼓风干燥箱,上海一恒；万分之一电子天平,奥豪斯公司；数显恒温水浴锅,江南仪器厂.

1.2 试验方法

1.2.1 新方法黑萝卜制备选择新鲜的白萝卜,切蒂、切根须；用刀纵向剖开为两半，再切分成较大块状；将切好的萝卜块放入烘箱烘制,烘烤温度设置为75 ℃,烘至失水50%左右；将烘后的白萝卜摆放在蒸盘中,放入密封蒸箱内,通入100 ℃水蒸气,蒸制2 h 左右；将蒸制的萝卜连同蒸盘一起放入烘箱内烘制,温度设置为75 ℃,烘至萝卜水分含量减少约一半；将烘制后的萝卜连同蒸盘一起移入蒸箱内蒸制,反复烘制蒸制直至白萝卜的外观呈现明显的黑色（约需要10 遍左右）,萝卜外观的黑化程度达到传统制作的陈放15 a 的腌制黑萝卜的黑色度后即得到新方法制备的黑萝卜.

1.2.2 三种萝卜提取液的制备将新方法制备的黑萝卜、新鲜白萝卜（新方法制备黑萝卜的原料）和市场购买的黑萝卜,三种样品切小块放置烘箱内85 ℃彻底烘干后粉碎,分别称取3 种萝卜粉末各1 g,分别倒入三个烧杯中,加入20 mL 蒸馏水,加热至沸腾并保持微沸30 min,抽滤,取滤出液,用蒸馏水定容至20 mL,即得到三种萝卜的水提取物.

1.2.3 三种萝卜紫外可见光光谱测定将三种萝卜提取液稀释到合适质量浓度, 采用紫外可见光分光光度计对三种萝卜提取物溶液在200 nm～800 nm 范围内进行光谱扫描[7].

1.2.4 含可溶性总糖量的测定提取物中含可溶性总糖量的测定采用苯酚- 硫酸法[8],标准品为彻底烘干至恒质量的葡萄糖,按照文献[8]方法步骤开展操作后,测得的标准线性回归方程为y=13.449x+0.010 3,R2=0.997,x 单位为mg.然后分别在494 nm 下测定3 种萝卜提取液的吸光值,带入标准曲线计算三种萝卜提取物中的含总糖量.

1.2.5 含黄酮类量的测定提取物中含黄酮类量的测定采用亚硝酸钠- 硝酸铝显色法[8],以无水乙醇配制的芦丁为标准品,测得的标准曲线回归方程为y=1.352x+0.012,R2=0.990 2,x 单位为mg,三种萝卜提取液提取方法参照1.2.2 分别测定的3 种萝卜提取液的吸光值,带入标准曲线计算三种萝卜含黄酮量.

1.2.6 含可溶性蛋白量的测定采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行测试,以试剂盒提供的牛血清白蛋白为标准品,操作步骤采用试剂盒方案,测得的标准线性方程为y=7.32x+0.006 2,R2=0.998 6,x 单位为mg.随后分别测定3 种萝卜提取液的吸光值,带入标准曲线计算出三种萝卜提取液的含可溶性蛋白量.

1.2.7 含总酚量的测定采用福林酚法测定提取物中含多酚类物质量[9],以没食子酸为标准品,测得的标准曲线回归方程为y=10.286x-0.005,R2=0.996 4,x 单位为mg,随后分别测定3 种萝卜提取液的吸光值,带入标准曲线计算三种萝卜含总酚量.

1.2.8 DPPH 自由基清除能力的测定将三种萝卜的提取物分别配成质量浓度为5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L 的测试液,然后采用文献[7]试验步骤测试三种提取物的DPPH 自由基清除能力.

1.2.9 ABTS+自由基清除能力的测定将三种提取物分别配成质量浓度为1 g/L、5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L 的测试液,ABTS+自由基的能力的测试方法参考文献[7]步骤进行.

1.2.10 羟自由基清除能力将三种提取物分别配成质量浓度为1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、10 g/L 的测试液,羟自由基清除能力的测试方法按照文献[7]步骤进行.

1.2.11 Fe3+还原抗氧化能力的测定将三种提取物分别配成质量浓度为3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L 的测试液,Fe3+还原抗氧化能力的测定步骤按照文献[7]方案进行.

1.3 数据处理

试验进行3 次重复.使用SPSS27.0 软件分析结果,组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,使用Origin8.5 软件作图.

2 结果与分析

2.1 黑萝卜制作结果

采用烘制和蒸制循环8 遍,即可以看到萝卜外观呈现明显的黑色,若继续增加循环次数至10 次,新方法制备的黑萝卜外观的黑色比市场购买的黑萝卜（老菜脯）更深（见图1）.

图1 三种萝卜外观比较Fig.1 Comparison of three kinds of radish appearance

2.2 三种萝卜样品的紫外-可见光光谱分析结果

三种萝卜样品200 nm～800 nm 光谱结果见图2,从光谱图可以看出新鲜白萝卜在可见光区400 nm～800 nm 间吸光值很小,在紫外光区（200 nm～400 nm）急剧增加,购买的和新方法自制的黑萝卜在波长小于600 nm 时吸光值开始增加,小于500 nm 后随着波长变短吸光值急剧增加,两种黑萝卜在可见光区的光谱几乎重叠,且光谱线平滑,说明新方法自制的黑萝卜与购买的黑萝卜的主要呈色化学成分的组成具有一致性.白萝卜在腌制过程中会逐渐发生褐变,褐变反应机制一般包括美拉德反应、抗坏血酸氧化分解、多酚类物质氧化缩合等[10],最终产生呈色为黑褐色的类黑精,新方法采用中高温烘制和蒸制的方法,同样有类似的美拉德反应等发生,产生相似呈色的类黑精等成分.

图2 三种萝卜样品的紫外- 可见光光谱Fig.2 UV-visible spectra of three kinds of radish samples

2.3 三种萝卜含可溶性总糖、可溶性蛋白质、总酚和总黄酮量

由表1 可知,自制的黑萝卜含总糖量与新鲜白萝卜的含总糖量相差不显著（P＞0.05）,均显著高于市场购买的黑萝卜（P＜0.05）.原因可能是购买的白萝卜原料本身含糖量较高,同时自制黑萝卜方法中的蒸制和烘制过程也可促进不溶性多糖降解为可溶性糖.有研究发现多糖热处理可促进不溶性多糖的降解,从而提高含可溶性糖的量[11].和新鲜的白萝卜相比,自制的黑萝卜中含可溶性蛋白的量显著性（P＜0.05）升高,高于市场购买的黑萝卜（P＜0.05）.推测在蒸制和烘制过程中,一些不溶性的结构蛋白在热作用下转变为可溶性蛋白.

表1 三种萝卜中的主要活性成份含量测定结果Tab.1 Results of main active component in three types of radish%

自制的黑萝卜中的含总酚和黄酮量显著（P＜0.05）高于市场购买的黑萝卜和新鲜白萝卜,推测蒸制和烘制过程中萝卜中的还原糖或羰基化合物在热处理中发生的聚合、缩合和美拉德反应等[12-13],生成新的多酚类、黄酮类、色素或类黑素等,这些物质也是食品色泽和风味的主要来源[14-15].

2.4 DPPH 自由基清除能力比较结果

三种萝卜在所设定的5 g/L～50 g/L 质量浓度范围内,对DPPH 自由基的清除能力随着提取物质量浓度的升高而增强（图3）.自制黑萝卜的DPPH 自由基清除能力比市场购买的黑萝卜和新鲜白萝卜要强.最低质量浓度下自制黑萝卜的清除率为33.38%,市场购买的黑萝卜的清除率为30.10%,新鲜白萝卜则为18.87%；在最高质量浓度下自制的黑萝卜清除率为88.00%,购买的黑萝卜的清除率为80.23%,新鲜白萝卜为67.17%.黄酮类和多酚类物质均具有很好的DPPH 自由基清除能力[16-17],这可能是自制的黑萝卜DPPH 自由基清除率较强的原因.

图3 3 种萝卜提取物清除DPPH 自由基能力结果Fig.3 Results on the ability of three radish extracts to scavenge DPPH radicals

2.5 ABTS+自由基清除能力的测定结果

三组萝卜提取物对ABTS+自由基的清除率先逐渐上升后趋于平稳（图4）.质量浓度在10 g/L～20 g/L时自制的黑萝卜清除ABTS+自由基的能力最强.三种萝卜对ABTS+自由基清除能力的不同可能与黄酮类物质含量的不同有关,自制黑萝卜具有最高的黄酮类物质含量,因而在一定质量浓度下清除自由基的能力最强.质量浓度在20 g/L～30 g/L 时,三种萝卜提取物的ABTS+自由基清除能力趋于一致,清除率均达到了80%以上.

图4 3 种萝卜提取物清除ABTS+自由基能力结果Fig.4 Results on the ability of three radish extracts to scavenge ABTS+free radicals

2.6 清除羟基自由基能力的测定结果

图5 结果表明自制的黑萝卜具有最强的羟自由基清除能力,市场购买的黑萝卜次之.在所设定的质量浓度范围内,三种萝卜提取液对羟基自由基的清除能力均随着质量浓度的增加而增强；同样质量浓度下自制的黑萝卜羟基自由基清除率最强,可能与其含黄酮类物质量最高有关[18].

图5 3 种萝卜提取物羟基自由基清除能力结果Fig.5 Hydroxyl radical scavenging ability of three radish extracts

2.7 Fe3+还原能力的测定

图6 结果表明在试验的质量浓度范围内,对Fe3+的还原能力随着提取液质量浓度的升高呈上升趋势,其中自制黑萝卜的Fe3+还原能力最强,新鲜萝卜次之,市场购买的黑萝卜最弱.分析认为可能是样品萝卜品种不同造成的,本试验自制的黑萝卜和新鲜白萝卜是相同的夏季种植的白萝卜,市场购买的黑萝卜品种不详,但民间一般是采用秋季白萝卜制作而成.可能是夏季种植的白萝卜中的某种活性成分较秋季的白萝卜高,且具有较好的Fe3+还原能力.

3 结论与讨论

新方法制备的黑萝卜外观呈现明显的黑色,与新鲜白萝卜相比,其所含的可溶性蛋白量、总酚量和总黄酮量显著（P＜0.05）提高.推测是制备黑萝卜的过程中,在热作用下萝卜中游离氨基酸和还原糖或羰基化合物发生了聚合、缩合等美拉德反应,促进一些黄酮和多酚类物质生成[13-15],也生成大量棕色、褐色甚至是黑色的类黑精或称为拟黑素的物质[12].同时热作用也促进了一些不溶性结构蛋白或大分子多糖的水解,从而产生了可溶性蛋白分子和糖类.

抗氧化试验结果表明购买的黑萝卜（传统老菜脯）和新方法制备的黑萝卜都具有有较强的抗氧化活性,一般认为腌制得到的老菜脯内含有较多的酚类、黄酮类物质,这些物质均具有较好的抗氧化活性[1].除黄酮和多酚类物质外,类黑精也具有一定的抗氧化活性[14].研究结果为新方法加工食用和保健兼具的黑萝卜提供了试验数据.