归脾汤对慢性疲劳综合征小鼠认知能力及炎症因子的影响

陈文钰 陈言 司国瑞 李晓龙 段萌媛 邓鑫鑫 户庆庆 陈俊儒 孟欣 黄克杰 平静涛 王鹏禹 马梦舸 李晓冰

(河南中医药大学医学院,河南 郑州 450008)

慢性疲劳综合征(CFS)是一种复杂的、使人衰弱的疾病,其特征是极度疲劳,不因休息而改善。CFS通常与焦虑、抑郁、神经内分泌异常及各种躯体疾病相关,特征不仅为严重疲劳,还常伴有神经内分泌、认知和免疫功能损伤〔1〕。研究发现,CFS患者外周血炎症因子水平较健康人明显升高〔2〕,提示CFS可能通过影响免疫系统从而导致机体微炎症状态〔3〕。现代医学对该病缺乏特异诊断标准和有效治疗方案。归脾汤始载于宋代《济生方》,是祖国医学经典名方,具有益气补血、健脾养心等功效。临床观察发现,归脾汤能显著消除患者疲劳感,对CFS疗效确切,临床应用广泛〔4〕。本研究立足中医传统理论,选取临床疗效确切的归脾汤对CFS小鼠模型进行干预,从炎症角度探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁健康 SPF级雄性小鼠30只,6～8周龄,体质量18～22 g,生产许可证号:SCXK-(豫)2019-0002。实验动物的饲养管理和实验操作过程均遵守河南中医药大学实验室相关规定。

1.2药物与试剂 归脾汤(药用白术30 g、人参15 g、黄芪30 g、当归15 g、炙甘草8 g、茯神30 g、远志15 g、酸枣仁30 g、木香15 g、龙眼肉30 g)购自河南张仲景大药房。乳酸试剂盒、白细胞介素(IL)-1测定试剂盒、肿瘤坏死因子(TNF)-α测定试剂盒均购自南京建成生物研究所。

1.3主要仪器 全自动酶标仪(美国Bio-tek公司);电热恒温培养箱(广州市康恒仪器有限公司);精密天平(上海奔普科技仪器有限公司);高速离心机(贝克曼库尔特公司);旷场箱、SA101B 动物跑台(江苏赛昂斯生物科技有限公司)。

1.4实验分组 将小鼠随机分成5组,即正常组、模型组、归脾汤低剂量(GPT-L)组、归脾汤中剂量(GPT-M)组、归脾汤高剂量(GPT-H)组。

1.5造模及给药 采用跑台式疲劳方法制备CFS小鼠模型〔5〕。除正常组外其余4组进入动物跑台造模4 w。第1周将每只小鼠放在速度为10 m/min的跑台上运动30 min。在第2、3周和第4周,运行轮的速度逐渐增加到12 m/min,13 m/min和17 m/min,持续时间从第3周延长到60 min。如小鼠疲劳,不愿继续运动,将从跑台前方滑入边缘触电网,迫使其必须继续运动,以避免电击。每周小鼠运行5 d休息2 d。造模后,GPT-L、GPT-M、GPT-H组按照3、6、12 g/(kg·d)剂量灌胃,连续2 w。

1.6取材 称量小鼠体质量,取小鼠外周血。取肾脏、肝脏称重并冰上匀浆。

1.7生化法检测血清乳酸水平 采用1.6中所得外周血,以3 000 r/min离心15 min后取上清,严格按试剂说明书测定血清乳酸水平。

1.8力竭游泳实验 将小鼠尾部固定一约为体质量5%的夹子,置入深为20 cm、水温20～25 ℃的游泳池内,记录小鼠从入水到力竭的时间。

1.9悬尾实验 将小鼠尾端1 cm部分固定于不锈钢板上,板面距离地面1 m左右,使小鼠呈倒挂状,观察5 min内的挣扎次数及不动时间。

1.10旷场实验 旷场实验箱底部为50 cm×50 cm×50 cm的正方形开阔地,被划分为25个黑线网格,中心9个网格被定义为中心区域。将动物放中心格中探索5 min,自动记录动物越过黑线次数(水平得分)、表现出竖立行为的次数(垂直得分)及平均速度。每次实验之间用75%乙醇清洗场地。

1.11Morris水迷宫实验 将圆形水箱分为4个象限,在水箱内部每个象限处贴上4个不同形状、不同颜色的标记物(标记物之间距离相等),将平台放在第四象限中间固定不动。定位航行实验:水箱温度为19～22 ℃,水的高度超过平台1 cm,将小鼠置于象限中央头朝平台内壁方向,当小鼠找到平台并在上面停留5 s,实验结束取出小鼠擦干,放进鼠笼。若小鼠1 min时未找到平台,则实验自动结束,需人工引导其到平台上,停留10 s取出。最后一次检测时不需引导,撤掉平台,时间限定1 min。观察1 min内潜伏期及运动总距离。空间探索试验:定位航行试验结束后,撤除平台。任选一相同入水点将小鼠放入水中,观察受试鼠的空间定位能力及在空间探索过程中的变化规律,记录小鼠平均速度及平台区域运动距离。

1.12酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α 采用ELISA法严格按照说明书操作检测血清IL-1、IL-6、TNF-α水平。

1.13统计学方法 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析。两两比较符合方差齐用LSD,不符合方差齐用塔姆黑尼或邓尼特。

2 结 果

2.1归脾汤对CFS血清乳酸水平、力竭游泳时间及悬尾实验影响 与正常组比较,模型组血清乳酸水平和悬尾静止时间明显升高、力竭时间和悬尾挣扎次数明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,GPT-M、GPM-G组血清乳酸水平显著降低、悬尾挣扎次数明显升高(P<0.05,P<0.01),GPT各组悬尾静止时间明显减少、力竭时间明显延长(P<0.05,P<0.01),见表1。

表1 归脾汤对CFS血清乳酸水平、力竭游泳时间、悬尾实验及旷场实验影响

2.2归脾汤对CFS旷场实验影响 与正常组比较,模型组平均速度、水平得分及垂直得分明显降低(P<0.01);与模型组比较,GPT各组平均速度、GPT-L、GPM-G组水平得分及垂直得分明显增加(P<0.05,P<0.01),见表1。

2.3归脾汤对CFS小鼠Morris水迷宫实验影响 与正常组比较,模型组定向巡航实验中逃避潜伏期、运动总距离显著提高,空间探索实验中平均速度、平台区运动距离明显缩短(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,CPT各组逃避潜伏期、运动总距离明显缩短,平均速度、平台区运动距离明显增加(P<0.05,P<0.01),见表2。

表2 归脾汤对CFS小鼠Morris水迷宫实验影响

2.4归脾汤对CFS外周血炎症因子影响 与正常组比较,模型组血清IL-1、IL-6及TNF-α浓度明显升高(P<0.01);与模型组比较,CPT各组IL-1、IL-6、TNF-α水平明显降低(P<0.01),见表2。

3 讨 论

CFS特征在于身体长期无法休息从而导致的严重疲劳状态。CFS多伴有不同程度中枢神经受损改变,如失眠、记忆力和注意力减退等精神认知功能障碍表现〔6〕。认知功能障碍是CFS的重要组成部分,主要影响执行功能,表现为注意力无法集中、信息处理速度变慢等。中医将CFS归为虚劳,认为脾虚是CFS发生的根本病机〔7〕,脾主生清,若脾气虚弱不能升清,上不得精微之滋养则九窍不通,脑失所养,而见头目眩晕,精神疲惫,记忆力减退〔8〕,其表现与CFS认知功能障碍相似。

本实验通过检测力竭游泳、悬尾实验、血清乳酸水平评价小鼠疲劳状态。力竭游泳实验是判断疲劳程度的经典行为学实验〔9〕,悬尾实验静止时间和挣扎次数反映小鼠体力变化〔10〕。血乳酸是缺氧状态下糖代谢产物,剧烈运动时体内乳酸升高,血乳酸水平可用来评定机体疲劳状态〔11〕。本实验提示,疲劳模型制备成功。旷场实验利用小鼠惧怕空旷、趋向探索陌生环境的天性,通过记录小鼠活动状态评估其自主探究行为〔12〕。Morris水迷宫实验反映小鼠空间记忆等认知能力〔13〕。本实验通过以上行为学实验综合评价小鼠认知能力,结果提示,归脾汤能影响CFS模型小鼠自主探究行为,提高小鼠空间记忆等认知能力。

CFS患者外周血IL-6、TNF-α及IL-1β水平显著升高,可加剧下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱,导致注意力下降、抑郁等中枢神经系统表现。近期研究发现IL-1和IL-6凭借与TNF-α相似的机制活化脑内的小胶质细胞和星形胶质细胞,使其进一步分泌 IL-1 和 IL-6,导致神经炎症,引发认知和记忆损伤,提示IL-6、TNF-α及IL-1β的持续存在可能与CFS认知障碍密切相关〔3,14〕。本结果提示,归脾汤对CFS模型小鼠炎症细胞因子有一定调节作用。